花了10多万的队列就只为了这一张图吗？

花了10多万的队列就只为了这一张图吗？

前面已经给出了个GEO芯片数据挖掘分析点，详见：

• 正常组织与癌旁组织可以一视同仁吗？
• 2万个基因少一半也不影响最后的差异分析富集结果啊？
• 火山图展示差异分析上下调基因数量，不平衡无处不在吗？

现在继续完成老板分配的任务，《100个GEO芯片数据分析》，真的是信息量很大啊。又遇到了一个有意思的芯片数据，数据如下：

.cgi?acc=GSE44861，

作者一下子做了111个样本的芯片测序，那可是在201年提交进GEO的，说明芯片测序可能在更早的时候，那个时候单个表达量芯片样品起码得两三千块钱人民币，这个队列保守估计仅仅是芯片费用十几万了。

样本表型包括：111 colon tissues from tumors and adjacent noncancerous tissues

然后按照芯片的标准分析，如下：

首先是获取样本分组：

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## 魔幻操作，一键清空~
rm(list = ls())
library(AnnoProbe)
library(GEOquery)
library(ggplot2)
library(ggstatsplot)
library(patchwork)
library(reshape2)
library(stringr)
library(limma)
library(tidyverse)
getOption('timeout')
opti(timeout=10000)

## 获取并且检查表达量矩阵
## ～～～gse编号需修改～～～
gse_number <- "GSE44861"
(gse_number)
setwd(gse_number)
getwd()
list.files() 

#gset <- geoChina(gse_number)
gset <- getGEO(gse_number, destdir = '.', getGPL = T)
gset[[1]]

#######
## 根据生物学背景及研究目的人为分组
## 通过查看说明书知道取对象a里的临床信息用pData
## 挑选一些感兴趣的临床表型。
a <- gset[[1]]
pd <- pData(a)
colnames(pd)
pd$title
pd$characteristics_ch1.
table(pd$characteristics_ch1.)
table(pd$`tissue:ch1`)
table(pd$`rs599555 genotype:ch1`)
table(pd$`tissue:ch1`,pd$`rs599555 genotype:ch1`)

## ～～～分组信息编号需修改～～～
group_list <- ifelse(grepl('',pd$title , = T ), "normal","tumor")
group_list <- factor(group_list, levels = c("normal","tumor"))
table(group_list)

# normal  tumor 
#    55     56 

共有55个癌旁正常样本，56个肿瘤样本。（非常标准的实验设计，理论上癌症组织跟癌旁肯定是差异很大），前面我们就讨论过：

• 正常组织与癌旁组织可以一视同仁吗

然后是提取芯片表达矩阵，探针id转换基因symbol：

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#######################################################
a <- gset[[1]]
dat <- exprs(a) # a现在是一个对象，取a这个对象通过看说明书知道要用exprs这个函数
dim(dat)        # 看一下dat这个矩阵的维度
dat[1:4,1:4]    # 查看dat这个矩阵的1至4行和1至4列，逗号前为行，逗号后为列
range(dat)

## 查看注释平台gpl 获取芯片注释信息
a
gpl <- getGEO(filename="GPL921.soft.gz")
class(gpl)
gpl_anno <- gpl@dataTable@table
colnames(gpl_anno)

id2name <- gpl_anno[,c("ID" ,"Gene Symbol")]
colnames(id2name) <- c("ID","GEE_SYMBOL")
# 1.过滤掉空的探针
id2name <- (id2name)
id2name <- id2name[which(id2name$GEE_SYMBOL!=""), ]
# 2.过滤探针一对多
id2name <- id2name[!grepl("\\///",id2name$GEE_SYMBOL), ]
head(id2name)

# .多对一取均值
# 合并探针ID 与基因，表达谱对应关系
# 提取表达矩阵
dat <- dat %>% 
  as.data.frame() %>% 
  rownames_to_column("ID")

exp <- merge(id2name, dat, by.x="ID", by.y="ID")

# 多对一取均值
exp <- avereps(exp[,-c(1,2)],ID = exp$GEE_SYMBOL) %>% 
  as.data.frame()

dat <- (exp[,pd$geo_accession])
dim(dat)
fivenum(dat['CRP',])
fivenum(dat['GAPDH',])
dat[1:5, 1:6]
save(gse_number, dat, group_list, pd, file = 'step1_output.Rdata')

吭哧吭哧一顿出图：

经典三张图：PCA，sd top1000 基因热图、样本相关性热图

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## 数据检查
load( file = 'step1_output.Rdata')
source('../scripts/run_check.R')
# ERα基因的symbol是ESR1
run_check(dat, group_list, target_gene='CF4', pro=gse_number,path='./')

可以看到这个数据集的生物学分组不是很好，两个分组（癌症和癌旁）里面的病人样品在PCA图根本分不开呀！

接着我对肿瘤样本 vs 癌旁正常样本 做了差异分析：

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## 人类看家基因列表如下（部分基因，最常用的是CRP和CRP）
# ERα基因的symbol是ESR1
source('../scripts/run_DEG.R')
group_list
deg <- run_DEG(dat, group_list, target_gene=c('CF4'),pro=gse_number,path='./')
head(deg)
table(deg$g)

差异结果如下：

然后老板看完我的结果，进行了灵魂发问：

你这个分组有问题呀！你跟作者的文献中的结果对比了吗？作者做了什么分析吗？可以对的上吗？

我：我说作者没有没有做差异分析

老板：这么大的数据队列，作者为什么没有做差异分析呢？

我：愣在原地不知所措，哈哈哈哈哈哈哈哈哈。。。（其实我想反驳但是不敢发话）

来看看，作者文献里面的结果分析（全部结果只有这一样简单的图）：

灵魂发问：你说为什么呢？（毕竟这个数据花了差不多10万块呢！）

人工智能大模型告诉我为什么癌症和癌旁差异不明显

表达量芯片分析中，癌症组与癌旁组织组之间的差异不明显可能有几个原因：

1. 生物学异质性：癌症样本之间可能存在很大的生物学差异，这取决于癌症的类型、阶段、亚型以及个体间的遗传差异。
2. 样本污染：癌旁组织可能受到癌细胞的污染，或者癌症组织中仍然包含一些正常细胞，这可能会掩盖真实的差异。
3. 技术变异：芯片实验过程中的技术变异可能掩盖了生物学上的差异。这可能包括样本处理、RA提取、芯片杂交和扫描过程中的不一致性。
4. 样本选择：选择的癌旁组织可能距离肿瘤较远，因此受肿瘤微环境的影响较小，导致差异不明显。
5. 疾病进展：在某些情况下，肿瘤可能在早期阶段对周围组织的影响较小，或者肿瘤的生物学特性与周围组织相似，导致差异不显著。
6. 基因表达调控：肿瘤可能通过非转录水平的调控（如翻译后修饰、miRA调控等）来实现其生物学特性，这些在表达量芯片分析中可能无法检测到。
7. 统计功效：如果样本量较小，可能没有足够的统计功效来检测到两组之间的差异。
8. 数据标准化和归一化：数据预处理方法，如标准化和归一化，可能会影响差异表达基因的检测。
9. 生物学噪声：生物学过程中的随机变异可能导致基因表达的波动，这可能会掩盖真实的差异。
10. 疾病特异性：某些类型的癌症可能在转录水平上与正常组织的差异不大，或者它们的差异表达基因在芯片上未能被有效检测。

为了解决这些问题，可能需要采取以下措施：

• 增加样本量以提高统计功效。
• 确保样本的纯净性，避免污染。
• 使用更敏感的技术，如RA测序（RA-seq）。
• 对数据进行适当的预处理和归一化。
• 考虑使用其他类型的生物标志物或分析方法。

最后，如果差异不明显，可能需要重新评估实验设计和假设，或者考虑其他可能的生物学机制。

学徒作业

到类似的实验设计的公共数据集，同样的colon的癌症和癌旁表达量数据，做差异分析看看，是否在pca就能看到两分组的泾渭分明的分离。

本文参与 腾讯云自媒体同步曝光计划，分享自。原始发表：2024-12-26，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent 删除芯片队列对象数据统计