算法开发

算法开发

• 英文标题： Inferring allele-specific copy number aberrati and tumor phylogeography from spatially resolved transcriptomics
• 中文标题：从空间解析转录组学推断等位基因特异性拷贝数异常和肿瘤系统地理学
• 发表日期：0 October 2024
• 文章类型：Article
• 所属期刊：ature Methods
• 文章作者：Cong Ma | Benjamin J. Raphael
• 文章链接：

Para_01

1. 在肿瘤内随时间和空间分析体细胞进化是癌症研究中的一个关键挑战。
2. 空间解析转录组学（SRT）在肿瘤中的数千个空间位置测量基因表达，但不会直接揭示基因组异常。
3. 我们引入了CalicoST算法，该算法可以从SRT数据中同时推断等位基因特异性拷贝数异常（CAs）并重建肿瘤的空间进化，或称地理遗传学。
4. CalicoST识别出重要的CA类别——包括中性杂合性丢失和镜像亚克隆CAs——这些是总拷贝数分析无法检测到的。
5. 使用来自人类肿瘤图谱网络的九名患者的数据，CalicoST达到了平均86%的准确性，比现有方法高出约21%。
6. CalicoST为两名具有多个相邻切片的患者在三维空间中重建了肿瘤地理遗传学。
7. CalicoST对来自癌症前列腺器官的多个SRT切片的分析显示，前列腺两侧存在镜像亚克隆CAs，形成了在遗传和物理空间上的分叉地理遗传学。

Para_01

1. 肿瘤通过获得体细胞突变而进化，包括单核苷酸变异（SVs）、拷贝数异常和大规模结构变异。
2. 对大块肿瘤或分离的单细胞中的体细胞突变进行测序，揭示了肿瘤内的遗传异质性，并使重建肿瘤的进化历史成为可能。
3. 同时，肿瘤在物理空间内表现出异质性并经历进化，根据与其他细胞和局部微环境的相互作用而扩展和退缩。
4. 将空间视角纳入体细胞进化研究是一个关键挑战，但因缺乏空间数据而受到阻碍。

Para_02

1. 最近在空间测序技术方面的进展为肿瘤时空演化的研究提供了有希望的方向。
2. 虽然高质量的空间DA测序将为时空演化研究提供理想的数据集，但此类技术仍在积极开发中，并未广泛应用于研究。
3. 然而，能够同时从组织中的数千个空间位置测量RA的SRT技术，在分析肿瘤内转录定义的细胞类型的空间组织方面到了广泛应用。
4. 尽管体细胞突变发生在DA中，并不是由SRT直接测量的，大规模的拷贝数变异会在基因表达中留下特征；即，基因组区域的缺失往往导致该区域内基因的低表达，而扩增则往往导致过表达。
5. 因此，从转录组数据中识别拷贝数变异是分析肿瘤体细胞演化的一个有前景的方向。

Para_0

1. 从单细胞或空间解析转录组学推断拷贝数变异（CAs）具有挑战性，因为观察到的基因表达变化可能有多种解释，如染质可及性和转录因子结合。
2. 通常很难确定观察到的基因表达变化是由于CAs还是其他原因造成的。
3. 现有的从基因表达数据中推断CAs的方法假设大的CAs会改变基因组区域中多个相邻基因的表达，超出其他调控效应所预期的水平。
4. 然而，基因间的表达变异性如此之大，以至于这些方法在推断CAs方面的准确性有限，并且在不同组织、患者和癌症类型之间不够稳健。
5. 一些方法试图通过结合单细胞RA测序（scRA-seq）和单细胞DA测序来解决这些挑战，但在同一肿瘤上同时进行这两种测序的情况并不常见。
6. 此外，scRA-seq和SRT都是稀疏的，通常在基因和细胞/点位上有超过75%的零计数。
7. 最后，常用的10x Genomics Visium和Slide-seqV2 SRT技术除了scRA-seq之外还带来了额外的挑战：它们在每个空间点位测量来自细胞混合物的RA。

Para_04

1. 重要的是，拷贝数变异（CA）改变两个亲本染体中的一个，因此识别‘等位基因特异性CA’对于全面描述肿瘤中的CA至关重要。
2. 例如，杂合性丢失的拷贝数中性事件（CLOH）——其中一个亲本染体区域被删除而另一个亲本染体被扩增，使得该位点的总拷贝数不变——在癌症中很常见。
3. 同样，镜像亚克隆CA——不同的癌细胞具有不同亲本等位基因的独立获得或丢失——在癌症中也很常见。
4. 重要的是，这些事件都不会改变细胞中基因组位点的总拷贝数。
5. 因此，这些事件在总拷贝数分析中是不可见的，这可能导致对肿瘤克隆的错误识别和不准确的肿瘤系统发育。
6. 大多数现有的从转录组数据检测CA的方法无法区分等位基因，而最近的一些用于从单细胞RA测序（scRA-seq）数据识别等位基因特异性CA的方法则面临着信号较弱，难以区分两个亲本等位基因的挑战。

Para_05

1. 我们介绍了CalicoST，这是一种从SRT数据中推断等位基因特异性拷贝数异常（CAs）的方法，并利用这些CAs重建肿瘤的空间进化过程，或称作地理谱系。
2. CalicoST能够识别出在全拷贝数分析中不可见的CLOH和镜像亚克隆CAs。
3. 地理谱系重建描述了等位基因特异性CAs随时间的累积以及肿瘤克隆在物理空间中的扩散。
4. 我们使用来自人类肿瘤图谱网络（HTA；WashU队列）的九名患者的SRT数据验证了CalicoST，这些患者有匹配的全外显子组测序（WES）数据。
5. CalicoST在其推断的等位基因特异性拷贝数上达到了至少86%的准确性，比以前的方法高出21%。
6. 我们为一名结直肠癌（CRC）患者和一名腺癌患者从HTA中重建了一个三维地理谱系，这些患者有多片相邻的切片。
7. 地理谱系揭示了肿瘤在第三个维度上的空间扩展方向，这是单一切片无法显示的。
8. 我们还将CalicoST应用于一名前列腺癌患者的多个SRT切片，识别出表明肿瘤趋同进化的镜像亚克隆CAs。
9. 重建的地理谱系将癌症克隆分为前列腺的左侧和右侧，揭示了克隆在物理和遗传空间上的分离。
10. CalicoST使得研究肿瘤的空间进化、进展和转移成为可能，并将有助于癌症诊断和的进一步应用。

CalicoST algorithm

CalicoST算法

Para_01

1. CalicoST 从肿瘤的一个或多个 SRT 样本中推断等位基因特异性拷贝数异常（CA）和肿瘤进化的谱系地理重建（图 1）。
2. CalicoST 具有以下关键特性：(1) 识别每个癌克隆转录区域的等位基因特异性整数拷贝数，揭示如 CLOH 和镜像亚克隆 CA 等总拷贝数分析无法检测到的事件。
3. (2) 为每个点分配一个克隆标签，指示该点的等位基因特异性拷贝数特征。
4. () 推断出与已识别的拷贝数特征（癌克隆）相关的系统发育关系以及结合体细胞进化和克隆空间扩散的谱系地理。
5. (4) 推断并在非单细胞分辨率的 SRT 技术中建模正常细胞混合（例如，10x Genomics Visium），以推断更准确的等位基因特异性拷贝数和癌克隆。
6. (5) 同时分析来自同一肿瘤的多个区域或对齐的 SRT 切片。

Fig. 1: CalicoST infers allele-specific copy numbers and a phylogeography of a tumor from one or more SRT samples from the same patient.

• a, CalicoST 的输入是转录本计数 X0、等位基因计数 Y0 和 D0 以及一个或多个 SRT 切片的空间坐标 S 或切片的 D 对齐。
• b, CalicoST 使用单倍型数据库对 Y0 和 D0 中的输入等位基因进行定相。可选地，CalicoST 使用 BAF 推断每个点的肿瘤比例。CalicoST 联合建模转录本计数和等位基因计数作为每个克隆内等位基因特异性拷贝数状态的函数。CalicoST 使用隐马尔可夫模型 (HMM) 建模相邻基因组区域之间拷贝数状态的相关性，并使用隐马尔可夫随机场 (HMRF) 建模分配给相邻空间位置的癌细胞克隆之间的相关性。
• c, CalicoST 推断一个或多个癌症克隆的等位基因特异性整数拷贝数，这些克隆之间的系统发育关系，克隆标签，每个点的可选肿瘤比例以及癌症克隆空间扩展的地理遗传模型。

Para_02

1. CalicoST 的输入是一个空间坐标矩阵 S，一个转录本计数矩阵 X0，其中的条目是每个点位上每个转录本的总读数，一个等位基因计数矩阵 Y0，其中的条目是非参考等位基因的读数数量，这些等位基因来自生殖系杂合单核苷酸多态性（SPs），以及一个总的等位基因计数矩阵 D0，其中的条目是相同一组生殖系杂合 SPs 的参考和非参考等位基因的总读数（图 1a）。
2. 矩阵 X0 可以通过标准的空间转录组分析管道轻松获得，而矩阵 Y0 和 D0 是通过一个专门的管道计算出来的，该管道在已知的生殖系 SPs 位置统计参考和非参考等位基因的读数。
3. 个别 SPs 的计数是稀疏的：98.8% 的 SP 位点在每个单独的点位内总计数为零，另有 0.9% 的 SP 位点只有一个总计数。
4. 为了减少稀疏性，CalicoST 使用一个单倍型数据库和点位伪批量中的等位基因计数来对 SPs 进行分相，然后对于每个点位，将同一单倍型在相邻基因组位置上的转录本计数和等位基因计数聚合起来，从而得到矩阵 X、Y 和 D。

Para_0

1. 此外，一些 SRT 技术（例如，10x Genomics Visium）可能缺乏单细胞分辨率，在每个空间点测量多个细胞。
2. 这种混合稀释了识别拷贝数变异和癌症克隆的信号。
3. 可选地，CalicoST 根据肿瘤中杂合性丢失区域的 B 等位基因频率 (BAF) 推断每个点的肿瘤比例 θ，并进一步使用 θ 推断完整的等位基因特异性拷贝数谱型。

Para_04

1. CalicoST 的核心是一个生成概率模型，该模型将观察到的变量 X 和 Y 表示为未观察到的等位基因特异性拷贝数和克隆标签 ℓ 的函数，给定 S 和 D。
2. X 和 Y 中的单个条目由于低测序覆盖率和其他变异来源（如可变基因表达）的干扰，对等位基因特异性拷贝数的估计较差。
3. 因此，CalicoST 使用隐藏马尔可夫模型（HMM）建模基因组中多个相邻位点之间拷贝数的相关性，并使用隐藏马尔可夫随机场（HMRF）建模相邻斑点之间克隆标签 ℓ 的相关性，假设相邻斑点可能具有遗传相似性。

Para_05

1. 最后，CalicoST 重建了一个系统地理模型，用于描述推断克隆之间的祖先关系以及这些克隆祖先的空间位置（图 1c）。
2. 从拷贝数谱型构建系统发生树具有挑战性，通常需要复杂的进化模型。
3. CalicoST 使用 LOH 事件推断癌症克隆的系统发生树，LOH 事件的重要特性是不可逆性；也就是说，一旦亲本单倍型在一个谱系中丢失，就无法恢复。
4. CalicoST 使用在 Startle 中实现的星同质模型构建肿瘤系统发生树，并使用扩散模型推断祖先克隆的空间位置。

CalicoST infers accurate allele-specific CAs in HTA

CalicoST 推断 HTA 中准确的等位基因特异性拷贝数变异

Para_01

1. 我们应用 CalicoST 推断了来自 HTA（WashU 队列）12 名患者（26 个切片）的 10x Genomics Visium 空间转录组学数据的等位基因特异性拷贝数（‘在 SRT 数据上运行 CalicoST’）。
2. 对于这 11 名患者中的 10 名，还获得了相邻大块肿瘤切片的 WES 数据，并使用 HATCHet2 为其中 9 名具有足够肿瘤纯度的患者推导出等位基因特异性的整数拷贝数（补充文本 11）。
3. 我们使用这些拷贝数作为基准，来评估 CalicoST 从 SRT 数据推断出的 CA。
4. 我们利用 CalicoST 预测的 LOH 区域中的等位基因频率信号估计每个点的肿瘤纯度（‘使用 BAF 推断肿瘤比例’），并在 CA 推断中显式建模推断的肿瘤比例（补充文本 ）。

Para_02

1. 在9名匹配的WES样本具有足够肿瘤纯度的患者中，CalicoST检测到的最佳匹配癌症克隆平均准确率为86%（最低68%，最高97%；图2a），并且在预测具有异常拷贝数的基因组区段时，平均精确率为95%，召回率为90%（补充文本12），分别（补充图1a，b）。
2. CalicoST检测到的CA事件的中位长度为77.4 Mb，通常跨越整个染体（图2b），这比通过HATCHet2在WES样本上检测到的CA分辨率低。
3. 尽管如此，CalicoST在高覆盖率区域识别出小至1 Mb的CA事件。

Fig. 2: CalicoST infers accurate allele-specific copy numbers in HTA samples.

• CalicoST 推断的来自 HTA（WashU 队列）12 名患者的等位基因特异性拷贝数的准确性。每个条形代表一个推断出的癌克隆。
• 通过 CalicoST 从 SRT 数据和 HATCHet2 从 WES 识别出的 9 名具有匹配 WES 数据且肿瘤纯度足够的患者的 CA 长度分布。蓝条形表示 CalicoST，橙条形表示 HATCHet2，灰条形表示两个直方图的重叠部分。CalicoST 的中位长度为 77.4 Mb，HATCHet2 的中位长度为 0 Mb（虚线）。
• 通过 CalicoST 从 SRT 数据推断出的一名 CRC 肝转移患者（HT20C1）的等位基因特异性整数拷贝数。行表示癌克隆，列表示基因组区间。颜表示等位基因特异性拷贝数。
• 通过 CalicoST 从 SRT 数据推断出的一名 CRC 肝转移患者（HT260C1）的等位基因特异性整数拷贝数。
• HT260C1 的 chr8 观察到的 RDR 和 BAF。点的颜由推断出的等位基因特异性拷贝数决定。水平黑线条表示 HMM 估计的相应拷贝数状态的 RDR 和 BAF。
• 通过 HATCHet2 从 WES 数据推断出的患者 HT260C1 的等位基因特异性整数拷贝数。
• 来自 WES 数据的 8q 染体区间和其他基因组区域具有 {,0} 拷贝数状态的区间 RDR 和 BAF 值。黑点表示 HATCHet2 分析中 {,0} 和 {2,1} 状态预期的 RDR 和 BAF 值。

Para_0

1. 我们通过三种方式评估了 CalicoST 推断的肿瘤比例。
2. 首先，我们观察到 CalicoST 推断的肿瘤比例与苏木精和伊红（H&E）染图像在视觉上一致（扩展数据图 和补充图 2 和 ）。
3. 其次，我们将 CalicoST 推断的肿瘤比例与每个点的肿瘤/正常标签注释进行了比较，这些标签是通过对 H&E 染图像的独立审查获得的，平均曲线下面积（AUC）为 0.85（补充表 5），其中两名患者（HT06P1 和 HT25C1）在杂合性丢失区域内的等位基因计数较少，导致 AUC 较低。
4. 第三，我们将 CalicoST 推断的肿瘤比例与 RCTD 估计的比例进行了比较，获得了平均皮尔逊相关系数为 0.76（补充图 4）。
5. 这是一个显著的一致性，因为 RCTD 需要匹配的单细胞 RA 测序来计算单个点的细胞类型比例，而 CalicoST 仅使用 SRT 数据。

Para_04

1. 我们评估了CalicoST在高正常细胞混杂（低肿瘤纯度）和复杂空间组织的肿瘤中推断拷贝数异常（CAs）和癌症克隆的能力。
2. 胰腺肿瘤以其这两种特征而闻名（例如，参考文献6），两名患有胰腺导管腺癌（HT270P1和HT288P1）的患者在全外显子组测序（WES）样本中的肿瘤纯度不足，无法识别CAs。
3. 在这两位患者的SRT数据中，CalicoST识别出多个癌症克隆（扩展数据图1a,c），LOH区域表现出明显的BAF差异（扩展数据图1b,d）。
4. 例如，CalicoST在HT270P1的2号克隆中识别出一个独特的10号染体（chr10）缺失，在HT288P1的1号克隆中识别出一个独特的4号染体（chr4）缺失，以及在HT288P1的2号克隆中识别出一个独特的8号染体（chr8）缺失。
5. 此外，腺癌样本HT9B1（扩展数据图）显示出复杂的几何形状，癌细胞在组织切片中弥漫分布，CalicoST推断每个点的肿瘤比例与肿瘤/正常标签注释一致（AUC = 0.81；补充表5）。
6. 通过在其概率模型中明确建模肿瘤比例（7）（8），CalicoST在该样本中实现了高度可靠的CAs：从CalicoST分析的SRT数据和HATCHet2分析的WES数据中，88%的基因组区间具有相同的等位基因特异性拷贝数（图2和扩展数据图2）。

Para_05

1. CalicoST 能够识别肿瘤倍性中的大规模变化，这通常很难推断，特别是对于仅推断总拷贝数的方法。
2. CalicoST 在三名结直肠癌肝转移患者（HT112C1、HT225C1 和 HT20C1；扩展数据图 2）中识别出接近三倍体的基因组。
3. 例如，患有结直肠癌肝转移的患者 HT20C1（图 2c）有 9.4% 和 15.1% 的基因组区间分别具有等位基因特异性拷贝数 {2, 1} 和 {2, 2}（图 2c），这与匹配的全外显子测序样本推断出的 CA 一致（补充图 5）。
4. 先前的研究显示三倍体与较差的预后/生存率差有关。
5. 等位基因信息是利用基因表达数据识别接近三倍体基因组的关键；仅推断总拷贝数变化的方法会遗漏许多具有 {2, 1} 拷贝数的区域，因为这些区域中的转录计数可能与拷贝数中性的区域没有显著差异，尤其是因为基因表达信号在整个基因组中高度可变（补充图 1c）。

Para_06

1. CalicoST 还揭示了肿瘤异质性和在批量 WES 数据中未发现的克隆特异性拷贝数变异。
2. 在患有 CRC 肝转移的患者 HT260C1 中，CalicoST 识别出的 CAs 是癌症克隆特有的，例如，克隆 中 chr2 的独特杂合性丢失，克隆 2 和 中的 chr8 杂合性丢失，而克隆 1 中没有（图 2d）。
3. 这两个事件都得到了 BAF 值的支持（补充图 6 和图 2e）。
4. 8q 区域在批量 WES 中被 HATCHet2 分配了一个 {, 0} 的拷贝数（图 2f），但其 8q 染体的 BAF 和读深度比（RDR）测量显示与 {, 0} 拷贝数状态预期的 BAF 值存在异常偏差（图 2g），支持 CalicoST 的假设，即该区域在不同的癌症克隆中经历了不同的等位基因特异性拷贝数。

CalicoST achieves high accuracy and spatial coherence

CalicoST实现了高精度和空间一致性

Para_01

1. 我们比较了 CalicoST 与现有用于从单细胞 RA 测序数据和空间转录组学数据中识别拷贝数异常的方法，评估了推断出的拷贝数异常的准确性以及推断出的癌细胞克隆的空间分布。
2. 具体来说，我们将 CalicoST 与以下方法进行了比较：umbat，一种针对单细胞 RA 测序数据的等位基因特异性拷贝数异常推断方法；STARCH，一种针对 SRT 数据的总拷贝数推断方法；以及 inferCV，一种针对单细胞 RA 测序数据的总拷贝数推断方法。
3. umbat 和 STARCH 并不输出整数拷贝数，而是输出拷贝数状态（例如，扩增、缺失），这些状态无法直接与 CalicoST 和 HATCHet 进行比较。
4. 因此，为了进行比较，我们将来自 CalicoST 和 HATCHet 的整数等位基因特异性拷贝数投影到拷贝数状态（补充文本 12 和 16）。

Para_02

1. 专注于四个具有最多 CA 事件的 CRC 肝转移样本，CalicoST 在所有样本上的准确性最高，推断等位基因特异性拷贝数的准确性比 umbat 平均高出 25%，推断总拷贝数的准确性比 STARCH 平均高出 59%，比 inferCV 平均高出 90%（图 a）。
2. 我们进一步比较了 HTA 中所有九名患者的两种等位基因特异性推断方法：CalicoST 的平均准确性比 umbat 高出 2%，并且对所有九名患者的准确性都更好（扩展数据图 4）。

Fig. : Accuracy and spatial coherence of inferred clones for CalicoST and other CA inference methods.

• a，b，在结直肠癌肝转移患者样本中，CalicoST、umbat、InferCV 和 STARCH 的准确性（a）和空间一致性（b）比较。实线表示等位基因特异性拷贝数状态的预测，虚线表示总拷贝数状态的预测。
• c，HT260C1 结直肠癌肝转移样本的 H&E 图像。
• d，通过 CalicoST 推断出的癌症克隆。x 轴和 y 轴是空间坐标，灰度代表每个点内正常细胞的比例，由 RCTD 推断得出。其他颜表示癌症克隆。
• e，使用与 d 相同的颜方案，通过 umbat 推断出的癌症克隆。

Para_0

1. CalicoST 推断出的癌症克隆的空间分布比 umbat 和 inferCV 在两个结直肠癌肝转移患者样本中的分布更加连贯，所有方法都识别出了多个癌症克隆（图 b，扩展数据图 4 和补充文本 1）。
2. 例如，在患者 HT260C1（图 c）中，CalicoST 识别出三个空间上连贯的克隆：左上方的克隆 1，右下方的克隆 2，以及被正常点（用灰表示）分隔开的这些克隆之间的克隆 （图 d）。
3. 相比之下，umbat 识别出的癌症克隆空间连贯性较低；例如，橙的癌症克隆在肿瘤区域的左右两侧都有斑点状分布，而这些区域被贯穿组织切片的正常点所分割（图 e）。

CalicoST infers tumor evolution in D space

CalicoST 推断三维空间中的肿瘤进化

Para_01

1. 我们应用 CalicoST 推断了两名 HTA 患者的三维空间（简称地理遗传学）系统地理树，这两名患者有多片相邻的 10x Genomics Visium 空间转录组数据：患者 HT112C1 结直肠肝转移样本包含两片间隔 60 微米的切片，患者 HT268B1 腺癌样本包含五片切片，其中四片之间的距离为 100 微米，前两片之间的距离未知。
2. 我们对相邻部分进行了对齐，并使用 PASTE2 获得了多切片对齐，将其输入到 CalicoST 中。

Para_02

1. 对于患有结直肠癌肝转移的患者，CalicoST 在 D 肿瘤组织中识别出三个空间上一致的克隆，并从这些克隆中的拷贝数变异推断出一棵系统发育树（图 4a）。
2. 这棵系统地理树显示了肿瘤的扩展，从祖先克隆 1（橙）分支到两侧的两个克隆（绿和蓝）。
3. 这三个克隆具有不同的等位基因特异性拷贝数谱型（图 4b）。
4. 具体来说，蓝克隆 在 21 号染体上有独特的杂合性丢失，而绿克隆 2 在 11p 染体上有独特的不平衡拷贝数变异事件。
5. 这两个事件都得到了 BAF 中强烈等位基因不平衡的支持（补充图 7a）。
6. 我们观察到两个切片之间克隆组成和定位的高度一致性，这并不令人惊讶，因为两个切片之间的距离（60 微米）很小，几乎与一个切片内斑点的直径（55 微米）相同。

Fig. 4: Tumor evolution in D inferred by CalicoST for patients HT112C1 and HT268B1.

• a, 利用 CalicoST 推断出的患者 HT112C1（患有结直肠癌肝转移）两个相邻切片中的三个癌克隆的空间分布和系统地理树。灰度表示每个点内推断出的正常细胞比例。钻石形状是每个克隆或推断祖先的空间质心，箭头指示肿瘤发展的推断方向。为了更清晰地可视化，两个切片在 z 坐标上的距离被放大了。
• b, 三个癌克隆的等位基因特异性拷贝数谱型以及相应的系统发育树（右侧），系统发育树的分支由该分支上发生的独特大缺失事件的数量标记。
• c, 利用 CalicoST 推断出的患者 HT268C1（患有腺癌）五个相邻切片中的两个癌克隆的空间分布和系统地理树。颜方案与 a 相同。
• d, 推断出的等位基因特异性拷贝数和肿瘤系统发育树。

Para_0

1. CalicoST 在腺癌患者 HT268B1 的五个切片中识别出两个癌症克隆，这些切片在三维空间中对齐，并重建了这两个克隆之间的系统地理学（图 4c）。
2. 19 号染体的一个镜像缺失区分了这两个克隆（图 4d），这一发现得到了 RDR 和 BAF 值的支持（补充图 7b）。
3. 系统地理学表明，祖先（黑钻石）位于两个克隆之间，由于与克隆 1 相比，克隆 2 具有较少的独特 LOH 事件，因此物理距离更接近克隆 2。
4. 该肿瘤的空间进化在 z 轴方向上具有很强的成分，展示了 D 系统地理学重建的优势。

Para_04

1. 我们通过分析来自患者 HT268B1 的两个切片（切片 1 和切片 4）来评估 CalicoST 在具有较大空间分离的肿瘤切片上的准确性，这两个切片之间的距离大于 200 微米。
2. 推断出的癌细胞克隆与从所有五个切片中推断出的克隆大致一致（调整后的 Rand 指数 = 0.996）。
3. 此外，CalicoST 在这两个切片上推断出的等位基因特异性拷贝数谱分别与从 WES 数据推断出的 CA 匹配了 79.2% 和 68.0% 的基因组，与从所有五个切片推断出的结果具有相似的准确性。
4. BAF 是识别远距离切片克隆的关键信号：切片 1 中的 BAF 值与每个克隆的切片 4 一致。
5. 这一结果表明，CalicoST 可用于分析来自远距离切片的 D 癌细胞克隆。

Mirrored subclonal CAs in a cancerous prostate organ

癌症前列腺器官中的镜像亚克隆CAs

Para_01

1. 我们应用 CalicoST 推断了来自一个癌症前列腺横截面的五个切片的等位基因特异性拷贝数变异和谱系地理（‘在 SRT 数据上运行 CalicoST’）。
2. CalicoST 在 SRT 切片中识别出五个具有不同拷贝数特征的癌症克隆（图 5a）（图 5b），每个克隆都由每个克隆中的 BAF 支持（补充图 9）。
3. 推断出的癌症克隆的空间分布与病理学家标注的肿瘤区域在文献 9 中所示的一致。
4. 值得注意的是，克隆 5（图 5a）出现在右侧前列腺的所有三个切片（H1_4、H1_5 和 H2_5）中，并形成一个连续的空间区域，尽管 CalicoST 并未提供有关切片在前列腺中相对位置的信息。
5. 从不同切片分配给克隆 5 的点的 BAF 值一致支持将这些点归类为同一克隆（扩展数据图 5c）。
6. 这种在多个切片中共享的克隆很难通过跨点的基因表达聚类来检测，因为克隆 5 的点在聚类中分裂成多个簇（扩展数据图 5a,b），这可能是由于批次效应或切片之间的生物学差异所致。
7. 这证明了 CalicoST 在多个切片上进行联合推断的优势以及 BAF 信号在切片间的稳健性。

Fig. 5: CalicoST infers a phylogeography and mirrored CA events in a multi-section prostate cancer sample.

• a, 通过 CalicoST 联合推断出的前列腺癌五个切片中的癌症克隆的空间分布。五个切片的位置根据参考文献确定。颜表示推断出的克隆，包括灰的正常克隆。箭头表示肿瘤进化的谱系地理。
• b, 五个癌症克隆及其相应的系统发育树的等位基因特异性拷贝数谱型，系统发育树的分支用该分支上发生的独特的大片段杂合性丢失事件的数量标记。颜表示等位基因特异性拷贝数。三角形的方向和位置表示镜像的 CA 事件。
• c, 每个克隆在第6号染体和第8号染体上的等位基因频率。颜使用与 b 相同的颜方案表示等位基因特异性拷贝数。

Para_02

1. 前列腺横截面（左侧和右侧）上的克隆通过多个拷贝数变异（CAs）区分开来。
2. 其中最显著的是四个镜像CA事件，发生在染体2、6和8上，克隆1和2与克隆4和5具有不同的扩增/缺失等位基因（图5c）。
3. 特别是，8p染体是前列腺癌中最常被删除的区域之一，显示出镜像删除，而8q染体则包含MYC基因的镜像扩增，MYC基因是侵袭性前列腺癌中一个著名的致癌基因。
4. 此外，6号染体在前列腺癌中常见的删除区域也显示出镜像删除，该区域包含ZF292、HMG和UBE2J1三个已报告的肿瘤抑制基因。
5. 镜像亚克隆CA提示可能存在独立于不同肿瘤克隆的趋同进化。
6. 相比之下，该数据最初发表的分析使用了基于InferCV15的SpatialInferCV，仅识别总拷贝数，并得出6q染体的删除是一个主干事件，忽略了前列腺两侧两个等位基因的差异丢失。

Para_0

1. 推断的系统地理学将癌克隆分为两个主要谱系，这与切片在物理空间中的左右分区相吻合（图5a）。
2. 在左半部分，克隆包含较少的CA事件，比克隆1和2更接近正常的二倍体基因组，而克隆1和2在染体1、2、4、5、6、8、10和11上共享许多缺失。
3. 在右半部分，克隆4与克隆5共享多个CA，但没有独特的CA，因此克隆4被标记为克隆5的祖先，这与其最接近根部的空间位置一致。
4. 有趣的是，缺乏主干CA事件以及遗传和物理空间中的明显分叉表明，肿瘤的左半部分和右半部分在非常早期阶段就分化了，并且具有相对独立的进化过程。
5. 与这一假设一致，我们在切片中鉴定出六个高可信度的体细胞SVs（‘多节段前列腺癌中体细胞SVs的鉴定’）。
6. 五个SVs在前列腺的左侧和右侧之间共享（扩展数据图6），可能是由肿瘤中所有癌细胞共享的主干事件。
7. 一个SV仅存在于前列腺左半部分的克隆1和2中（扩展数据图6；chr10:772972），支持使用CalicoST CAs推断的系统发生树，其中克隆1和2是两个同源节点。

CalicoST analysis of Slide-tags data and simulated data

CalicoST对Slide-tags数据和模拟数据的分析

Para_01

1. 我们使用 CalicoST 分析了一个使用 Slide-tags 技术测定的人类黑素瘤样本，该技术实现了单细胞空间分辨率，并且可以使用 10x Genomics Multiome ATAC + 基因表达平台进行空间多组学分析。
2. 利用 RA 数据，CalicoST 识别出三个空间上一致的癌克隆（扩展数据图 7 和补充文本），以及一个原始研究中未报告的额外克隆。

Para_02

1. 我们使用两组模拟数据评估了 CalicoST 的准确性。
2. 首先，我们生成了 90 个模拟样本，每个癌症克隆内的 CA 数量和长度各不相同，并观察到与 umbat 和 STARCH 相比，CalicoST 在识别癌症克隆和识别 CA 方面达到了最高的准确性。
3. 接下来，我们生成了 15 个具有不同空间组织复杂性的模拟样本，发现 CalicoST 在区分癌细胞和正常细胞方面具有很高的准确性。

Para_01

1. 我们介绍了 CalicoST，这是一种算法，利用 SRT 数据推断等位基因特异性拷贝数，并重建与时间空间相关的癌症克隆的系统地理学。
2. CalicoST 利用推断出的杂合性丢失事件构建了与癌症克隆相关的系统树和空间系统地理学，将肿瘤的基因组和空间进化整合到一个统一的模型中。
3. 当有多个切片可用时，CalicoST 推断跨切片的联合系统地理学，包括肿瘤空间进化的 D 模型。

Para_02

1. CalicoST 存在几个限制和未来改进的方向。
2. 首先，CalicoST 需要有足够的杂合 SP 覆盖率才能获得信息量丰富的 BAF 值。
3. 因此，低覆盖率的 SRT 技术，如 Slide-seqV2，其每个点位仅约有 0 条覆盖 SP 的读数，在应用 CalicoST 之前需要聚合邻近点位的计数，这会导致空间分辨率的相应损失。
4. 此外，基于探针的技术，如用于分析福尔马林固定石蜡包埋组织的 10x Genomics Visium CytAssist，不进行 SP 测序，因此无法识别等位基因特异性 CA。
5. 其次，可靠检测到的 CA 长度受到测序覆盖率以及从基因表达数据中检测 DA 异常固有难度的限制。
6. 这种分辨率取决于基因组区域内基因的密度以及包含异常的点位数量。
7. 然而，几乎不可能检测到只包含一个基因的异常，因为这些异常与差异表达无法区分。
8. 第三，CalicoST 利用 LOH 事件作为系统发育标记有助于推断准确的系统发育树，但这要求肿瘤样本中有足够多的这些事件。
9. 利用其他 CA 进行系统发育重建可能允许对更多的肿瘤样本进行系统发育推断，但这需要准确的拷贝数进化模型。
10. 第四，CalicoST 当前在推断高拷贝扩增的准确整数拷贝数方面存在困难，因为基因表达的方差较高。
11. 例如，CalicoST 推断 HTA 患者 HT260C1 的 1 号染体在推断出的癌细胞克隆中总共有三个和四个拷贝，而通过 WES 数据由 HATCHet 推断的总拷贝数为五个。
12. 第五，可以通过更快的优化算法或 GPU 进一步提高 CalicoST 的运行时间；当前运行时间为 2 到 8 小时（补充图 1），瓶颈在于负二项分布和贝塔二项分布的参数拟合。
13. 第六，可以在选择克隆数量（补充文本 10）和 HMRF 中的空间一致性参数（补充文本 5）的模型选择标准上进行进一步改进。
14. 特别是对于含有空间组织较少的癌细胞的肿瘤样本，强烈的空间一致性先验可能导致 CA 和癌细胞克隆的不准确推断。
15. 最后，CalicoST 可以扩展到其他空间测量技术，如结合转座酶可及染质测定和测序的空间 ATAC-seq，或者结合匹配的 WES 数据或谱系追踪实验，结合不同技术的优点并克服其局限性。

Para_0

1. SRT 在癌症分析中的应用正在迅速增长。
2. CalicoST 可以帮助深入了解癌症的拷贝数驱动因素、肿瘤的空间异质性和空间演化，为整合遗传进化、表观遗传变化和细胞类型空间组织的进一步生物学分析奠定基础。
3. CalicoST 还可以通过表征药物耐受克隆与药物敏感克隆之间的空间结构和微环境差异，从新的角度研究药物抗性。

CalicoST workflow

CalicoST 工作流程

Para_01

1. CalicoST 包含以下主要步骤（补充图 14）。
2. 在初步步骤（步骤 0）中，CalicoST 使用一组已知的生殖系杂合 SP 位点（目前从 1000 基因组第三阶段获得），并提取参考等位基因和替代等位基因的计数，这为推断等位基因特异性拷贝数变异提供了关键信息。
3. CalicoST 使用参考单倍型数据库和基于人的 SP 单倍型推断算法 Eagle2 来推断每个 SP 的初始单倍型（也称为定相）。
4. 所得的单倍型对邻近的 SP 通常质量较高，但对远距离的 SP 容易发生转换错误（补充文本 1）。
5. 在步骤 1 中，CalicoST 接下来尝试使用结合所有点的等位基因计数计算出的 BAF 来纠正基于人的单倍型中的潜在错误；也就是说，创建一个伪整体样本（‘单倍型和分箱’），因为所有细胞具有相同的母源/父源单倍型。
6. 然后，CalicoST 将基因组划分为不重叠的连续区段，并根据每个区段内 SP 的单倍型聚合转录本计数和等位基因计数。
7. 在步骤 2 中，CalicoST 通过直接从每个点推断出的肿瘤纯度（‘使用 BAF 推断肿瘤比例’）或通过初始聚类点来识别正常点，通过单倍型 BAF 聚类并识别中心最接近 BAF = 0.5 的聚类（补充文本 7）。
8. 推断出的正常点提供了正常细胞中的基线基因表达；高于基线的表达可能是由于拷贝数增加，而低于基线的表达则表明拷贝数减少。
9. 此外，我们使用正常点去除可能与拷贝数变异无关的等位基因特异性基因表达的基因组区段（补充文本 8）。
10. 在步骤 中，CalicoST 将基因组区段聚类为‘拷贝数状态’，同时推断癌克隆（‘拷贝数变异和克隆推断问题’；补充文本 2-6）。
11. CalicoST 明确建模了沿基因组的基因组区段之间的相关性，以及空间上癌克隆之间的相关性，使用 HMM 和 HMRF 分别进行建模。
12. 简而言之，CalicoST 估计 HMM 中每个隐藏的拷贝数状态的 RDR 隐变量——对应于相对于二倍体的相对拷贝数——以及 BAF 隐变量——指示两个等位基因之间拷贝数的不平衡。
13. CalicoST 通过识别和合并具有相似拷贝数谱型的克隆来启发式地选择癌克隆的数量，使用用户定义的初始克隆数量推断的隐 RDR 和 BAF 值（补充文本 10）。
14. 在步骤 4 中，CalicoST 到每个拷贝数状态下最能解释推断的隐 RDR 和 BAF 的等位基因特异性整数拷贝数（补充文本 9）。
15. 在最后的步骤 5 中，CalicoST 通过使用推断的 LOH 事件推断系统发育并投影到空间上来重建肿瘤的地理遗传学（‘重建肿瘤地理遗传学’）。

Para_02

1. 我们为CalicoST的步骤1（‘相位和分箱’）、步骤（‘拷贝数变异和克隆推断问题’）以及步骤5（‘重建肿瘤系统地理学’）提供了更多细节。见补充文本以了解其他步骤的详细信息。

Para_0

1. 当 CalicoST 被要求估计每个点的肿瘤纯度时，CalicoST 首先通过运行第 1 步到第 步来识别具有 LOH 的基因组区域，假设每个点包含同质的正常细胞或克隆，然后使用 BAF 估计肿瘤纯度（‘使用 BAF 推断肿瘤比例’）。
2. HTA（WashU 队列）、多节段前列腺癌样本和 Slide-tags 样本的分析细节描述在‘在 SRT 数据上运行 CalicoST’和‘识别多节段前列腺癌中的体细胞 SVs’中。

Phasing and binning

相位和分箱

Para_01

1. 初步步骤（第0步）生成了一个包含单倍型1的体相位等位基因计数矩阵Y0和一个包含两个单倍型计数总和的总等位基因计数矩阵D0；每行表示一个基因组位点，每列表示一个点。
2. 在计算这些矩阵时，CalicoST根据用户指定的阈值排除了总唯一分子标识符（UMI）计数或SP覆盖UMI计数过低的点，该阈值设置为50。
3. CalicoST还排除了以下基因：（1）表达量低于用户提供的点百分比的低表达基因（我们在论文分析的所有数据集中使用了0.5%），（2）通过异常检测算法，局部异常因子检测到表达量过高的基因，（）免疫球蛋白基因（212个基因）和/或HLA区域内的基因（21个基因），已知这些基因即使没有拷贝数变异也具有较大的表达变异性。
4. CalicoST进一步排除了位于基因间区和HLA区域的SP。

错误！！！ - 待补充 错误！！！ - 待补充

Para_04

1. 这给出了 HMM 的发射概率。我们假设隐藏状态对中的元素 hg 和 zg 在初始概率和状态转移概率中是独立的：

Para_05

1. BAF状态和相之间的转变分别定义如下：

Para_06

1. 我们使用 Baum-Welch 算法估计参数并对隐藏状态进行最大后验概率（MAP）估计。
2. 使用伪批量样本，HMM 在所有点上输出一个相位向量 h。
3. 相比之下，umbat 推断每个癌细胞克隆的独立相位及其拷贝数变异（CA）状态，这可能导致相位和 CA 推断中的错误。

Para_07

1. 使用由 HMM 模型估计的相位，CalicoST 接下来在基因组区间内对每个单倍体的计数进行聚合。
2. 具体来说，CalicoST 将基因组划分为连续且不重叠的区间，并计算每个基因组区间 j 和点 s 的单倍体 1 的相位等位基因计数 Yj,s 以及通过聚合 Y0 和 D0 的计数得出的总计数 Dj,s。

Para_08

1. 此外，CalicoST 聚合了位于每个基因组区间内的转录本计数 X0 到 X。
2. 应用由参考文献 4 引入的可变长度区间划分，我们通过要求每个区间内所有点位的等位基因总计数之和超过用户定义的最小值来确定每个区间的大小，除非该区间位于染体末端。
3. 这种区间划分程序生成足够的计数，以便在 CalicoST 后续步骤中推断拷贝数变异（CAs）（补充图 15f）。
4. 定相和区间划分允许区分定相后的 BAF 值中的小变化。
5. 例如，在 HTA 患者 HT260C1 中，克隆 2 的 chr 上 BAF 从平衡值 0.5 的微小偏差明显区别于 chr4 和 chr5 上的大偏差以及 chr11 上的无偏差（补充图 15g）。
6. 我们将推断出的单体型 1 称为 B 单体型/等位基因，单体型 2 称为 A 单体型/等位基因。
7. 相应地，这两个单体型的拷贝数分别为 B 拷贝和 A 拷贝。

CAs and clone inference problem

CAs 和克隆推断问题

错误！！！ - 待补充

Para_02

1. CalicoST 解决了推断 ℓ、A 和 B 的最大似然估计的问题。
2. 除了 SRT 数据外，这个问题的可选输入还包括多个切片的对齐 W 和每个点的‘肿瘤比例’θ = [θn] ∈ [0, 1]。
3. CalicoST 解决了 CA 和克隆推断问题。

Para_0

1. CA和克隆推断问题。给定SRT数据（X，Y，D，S），多个切片的对齐W（可选），肿瘤比例θ（可选）和克隆的数量M，到克隆标签ℓ和整数等位基因特异性拷贝数A和B，使数据的对数似然最大化，如公式所示：

Para_04

1. 在概率模型的符号表示中，我们用分号将条件随机变量与参数和常量分开，也就是说，在方程（1）中，ℓ 和 Z 是随机变量，而 A、B、λ、D、θ 和 W 是参数或常量。我们也把可选输入放在括号里。

Para_05

1. 用整数值的 A 和 B 解决这个问题是具有挑战性的。
2. 值得注意的是，X 和 Y 的概率模型涉及从 A 和 B 导出的分数（补充文本 2）。
3. 早期关于拷贝数推断的工作将整数拷贝数转换为一组离散的实值潜在参数：读深度比（RDR）μ 和 B 等位基因频率（BAF）p。
4. 我们使用相同的参数转换，并将问题分为两个步骤：CalicoST 推断克隆标签和潜在的 RDR 和 BAF 参数；CalicoST 从估计的 RDR 和 BAF 参数推断 A、B。

错误！！！ - 待补充

Para_07

1. 拷贝数状态和克隆推断问题。给定 SRT 数据（S，X，Y，D），多个切片的对齐 W（可选），肿瘤比例 θ（可选）和克隆数量 M，寻最大化数据对数似然性的克隆标签 ℓ、拷贝数状态 Z、潜在 RDR μ 和 BAF p，如公式（2）所示：

错误！！！ - 待补充

Para_09

1. CalicoST 使用块坐标上升法优化（公式（2）），并迭代求解 ℓ 和 μ、p、Z。给定 ℓ，我们使用补充文本4中的HMM求解 μ、p、Z；给定 μ、p、Z，我们在补充文本5的HMRF下求解 ℓ。

Inferring tumor proporti using BAF

使用 BAF 推断肿瘤比例

Para_01

1. CalicoST 包含一个可选过程，用于从受 LOH 事件影响的基因组区域的 BAF 估计每个点的癌细胞比例。
2. 虽然许多方法使用特定细胞类型的基因表达参考来解卷积细胞类型比例5,49,50,51，但 CalicoST 利用 BAF 值实现无需参考的肿瘤和正常比例解卷积。
3. 首先，假设受 LOH 事件影响的基因组区间由 R 表示，并且为了不失一般性，假设 B 等位基因丢失了。
4. 如果一个点只含有具有 LOH 的癌细胞，那么 LOH 区域内所有基因组区间的 BAF 将为 0。
5. 如果一个点只含有正常细胞——按定义没有体细胞拷贝数变异——BAF 在常染体上将接近 0.5。
6. 设 f 为给定包含癌细胞和正常细胞混合物的点在 LOH 区域的相位 BAF，f 将介于 0 和 0.5 之间，并且与肿瘤比例 θ 和 RDR μ 根据方程 () 相关：

Para_02

1. 方程()给出了使用LOH处观察到的BAF对给定点肿瘤比例θ的如下估计：(\theta =\frac{0.5-f"}{0.5+\mu f-f"})。
2. 我们应用此方程，使用所有LOH区域（可能包括多个染体）的BAF f的稳健估计，通过结合所有具有LOH的基因组区间中的UMI计数：(f=\frac{{\sum }{g\in R"}{Y"}{g,i"}}{{\sum }{g\in R"}{D"}{g,i"}})。

Para_0

1. 实际上，受 LOH 影响的基因组区间在先验上是未知的。
2. 我们通过运行 CalicoST 的第 1 步到第 步来预测肿瘤中可能受 LOH 影响的基因组区间（补充图 14），假设每个点包含一个单一克隆（补充文本 2），仅使用 BAF 值。
3. 这导致根据估计的 BAF 值对基因组区间进行聚类。
4. 我们将 LOH 区域推断为那些估计的 BAF 值与平衡区域预期的 0.5 值相差超过用户定义阈值（默认值 = 0.2）的聚类。

Rectructing tumor phylogeography

重建肿瘤的地理谱系

Para_01

1. CalicoST 通过两个步骤从推断出的等位基因特异性拷贝数 A、B 重建肿瘤地理学。
2. 首先，CalicoST 使用 LOH 事件作为系统发育标记来构建癌细胞克隆之间的系统发育树。
3. LOH 事件是不可逆的系统发育特征：如果一个祖先癌细胞丢失了一个等位基因的一个区域，其后代细胞无法重新获得该区域。
4. 此外，LOH 事件通常比其他 CA 推断得更准确，因为这些事件具有最不平衡的 BAF 值（见补充表 4，多部位前列腺癌样本中克隆 1 的 LOH 事件的 BAF 值）。
5. 我们在不可逆性假设下使用 Startle 构建高置信度的 LOH 事件的系统发育树。
6. 在此构建过程中，我们限制到包含用户定义的最小基因组区间数（默认值 = ）且在相应克隆的所有点上由用户定义的最小 SP 覆盖 UMIs 数量支持（默认值 = 100）的 LOH 事件。

Para_02

1. 为了推断谱系地理，CalicoST 将叶节点（对应于推断出的克隆）投影到空间中涉及斑点的中心（用 sv 表示节点 v），并使用高斯扩散模型推断祖先节点的空间位置。
2. 具体来说，我们假设系统发育树中节点 v 与其父节点 p(v) 之间的空间距离遵循高斯分布，该分布的方差与边上的突变数量 wv,p(v) 成正比，如公式(4)所示：

Para_0

1. 我们通过最大化所有节点的空间位置的联合概率来估计系统发生树中的祖先位置，这些位置用上述高斯分布表示，如公式（5）所示：

Para_01

1. 测序数据是 HTA dbGaP 的一部分，登录号为 phs00271.v.p1。
2. 这些数据可以通过 HTA DCC 门户网站（/）获取，位于 HTA WUSTL Atlas 下。
3. 多区域前列腺癌样本的测序数据从欧洲基因-表型档案库中获得，登录号为 EGAS00001006124。
4. HTA 和多区域前列腺癌数据的 CalicoST 输出数据可通过 .5281/zenodo.1667151 在 Zenodo 上获取。

Para_01

1. 代码在 BSD 条款许可证下公开发布于 /。
2. 用于分析的代码版本可通过 .5281/zenodo.1098655 在 Zenodo 上获取。