ature ecDA 系列

ature ecDA 系列

前言： ature 807 期有一系列关于 ecDA 研究的文章。 Extrachromosomal DA：ecDA。 链接：综述精读 | 癌细胞中的染体外DA 链接：ature | 10万基因组项目的14,778名患者的9种肿瘤类型ecDA的研究 链接：ature ecDA 系列 | ecDA 如何促进癌症的进化 链接：ature ecDA 系列 | 癌细胞中 ecDA 的协调遗传

• 英文标题：Enhancing transcription–replication conflict targets ecDA-positive cancers
• 中文标题：增强转录-复制冲突靶向ecDA阳性癌症
• 发表日期：06 ovember 2024
• 文章类型：Article
• 所属期刊：ature
• 文章作者：Jun Tang | Howard Y. Chang
• 文章链接：

Para_01

1. 细胞外染体DA（ecDA）对癌症患者构成了重大挑战。
2. ecDA通过促进大量致癌基因转录和快速基因组进化，使肿瘤对产生耐药性，导致患者生存率低下。
3. 目前，尚无针对ecDA的特定方法。
4. 在这里，我们展示增强转录-复制冲突能够靶向消除含有ecDA的癌症。
5. 逐步分析ecDA转录揭示了普遍存在的RA转录和相关的单链DA，与染体位点相比，这导致了过度的转录-复制冲突和复制压力。
6. ecDA上的核苷酸掺入明显较慢，无论癌症类型或致癌基因负荷如何，含有ecDA的肿瘤中的复制压力显著更高。
7. pRPA2-S是一种结合单链DA的DA损伤修复介质，在依赖转录的方式下在ecDA上显示出更高的定位，伴随着增加的DA双链断裂和S期检查点激酶CHK1的激活。
8. 遗传或药理学抑制CHK1会导致含有ecDA的肿瘤中广泛的且优先的肿瘤细胞死亡。
9. 我们推进了一种高度选择性、高效且生物可利用的口服CHK1抑制剂BBI-2779，该药物优先杀死含有ecDA的肿瘤细胞。
10. 在一个含有FGFR2扩增在ecDA上的胃癌模型中，BBI-2779抑制肿瘤生长，并防止ecDA介导的对泛FGFR抑制剂infigratinib的获得性耐药，从而在小鼠中实现强大且持久的肿瘤消退。
11. 转录-复制冲突作为ecDA定向的目标出现，利用过量的合成致死性来癌症。

Para_01

1. 染体外DA（ecDA）是多种癌症类型中常见的致癌基因扩增机制，并且与比其他类型的局灶性扩增更差的患者预后相关。
2. ecDA 可以在癌症向恶性转化、发展和进展过程中出现，它们具有独特的生物学特征，为恶性细胞提供了适应优势。
3. ecDA 的无中心结构促进了随机分离、高度升高的拷贝数、肿瘤内遗传异质性和快速的肿瘤进化，这有助于侵袭性肿瘤生长和抵抗。
4. ecDA 的环状拓扑结构也深刻改变了转录。
5. 与非环状扩增相比，ecDA 展现了高度可访问的染质和增加的致癌基因表达，即使在控制 DA 拷贝数之后也是如此。
6. 此外，ecDA 可以在细胞核中聚集，形成新的功能性增强子-启动子相互作用，既包括顺式也包括反式。
7. 早期研究显示，ecDA 高度转录注释的蛋白质编码基因，但尚不清楚 RA 转录的全貌——如基因间、反义或其他长链非编码 RA——是否改变。
8. ecDA 表现出开放的染质，并标记有活跃的组蛋白修饰，如 HK27ac 和 HK4me，这提示可能存在更宽松的转录环境。
9. 我们假设 ecDA 的高度可访问的染质可能产生一种可利用的脆弱性。

Para_01

1. 为了验证这一假设，我们进行了全局运行测序（GRO-seq）和核糖体RA（rRA）耗尽的RA测序（Ribo-Zero），分别用于分析新生转录本和累积的RAs（图1a），从而提供了ecDAs产生的RA生物合成的全面景观。
2. 为了控制局灶性扩增的影响并评估ecDA特异性的转录变化，我们关注了一对从同一患者衍生的同基因结直肠癌细胞系：COLO20DM（ecDA上的MYC扩增，也称为双分钟（DM））和COLO20HSR（染体上的MYC扩增在均质染区域（HSR）），通过全基因组测序（WGS）揭示，这两种细胞系在扩增子拷贝数上几乎匹配（扩展数据图1a,d）。
3. 值得注意的是，与COLO20HSR相比，COLO20DM在新生RA和累积RA读取密度方面显示出近4倍的增加，超出了由扩增子拷贝数差异预期的水平（图1b）。

Fig. 1: Pervasive transcription on ecDA drives ssDA accumulation.

• a, 相关基因组检测的示意图。
• b, 在 COLO20DM 和 COLO20HSR 中，基因组检测在 ecDA 区间内的读取密度（每百万总读数计数，CPM）。
• KAS-seq 读取密度显示为 KAS-seq 相对于片段化但未进行生物素富集的总 DA 输入的 CPM。
• GRO-seq、Ribo-Zero 和 KAS-seq 显示的是两个生物学重复的平均值；WGS 显示的是单个重复。
• c, 突出显示 ecDA 区间内两个区域的基因组轨迹。
• HK6me 染质免疫沉淀后测序（ChIP–seq）显示为相对于输入的归一化覆盖率的对数值。
• d, 在 ecDA 区间内，GRO-seq、Ribo-Zero RA 测序（RA-seq）和 KAS-seq 相对于输入的归一化覆盖率的对数值的元基因热图可视化。
• 所有图均以 HOMER 使用 COLO20DM 和 COLO20HSR 的两个生物学重复的 GRO-seq 数据识别的转录起始位点（TSS）为中心锚定。
• e, 元基因图显示在 ecDA 区间内的 GRO-seq 和 HK6me ChIP–seq 覆盖率。
• 所有图均以 HOMER 使用两个生物学重复识别的 GRO-seq TSS 为中心锚定。HK6me ChIP–seq 覆盖率显示为 log2(HK6me/输入)。
• f, 在 ecDA 区间内，根据 GRO-seq 数据和 Gencode v.4 注释的转录状态注释的两个生物学重复的 KAS-seq 峰。
• c、d 和 e 中每个条件的一个代表性生物学重复被可视化。chr amp，染体扩增；RA Pol II，RA 聚合酶 II。

Para_02

1. 转录的增加不仅限于 MYC 癌基因，而是遍布整个 ecDA，包括非编码、反义和许多先前未注释的转录本（图 1c，d）。
2. 这种广泛的转录增加是特定于 ecDA 的，因为 GRO-seq 和 Ribo-Zero 读段密度在 COLO20DM 和 COLO20HSR 的染体上是可比的（扩展数据图 2）。
3. 我们使用 GRO-seq 数据在扩增子区间内进行了从头转录本鉴定，并比较了 COLO20DM 和 COLO20HSR 中的相同区域。
4. 与 COLO20HSR 相比，我们在 COLO20DM 中观察到新生和累积转录本的增加，证实了 ecDA 上的转录增加是扩增子范围内的，而不是由少数差异表达的转录本驱动的（图 1d）。
5. ecDA 转录区域，包括那些先前未注释的区域，也被 HK6me 组蛋白标记，这与 RA 聚合酶 II 延伸相关，提供了广泛转录的正交验证（图 1c，e 和扩展数据图 a）。

Para_0

1. 高转录与单链DA（ssDA）积累有关，这是由于转录过程本身、RA:DA杂交体形成的R环以及转录-复制冲突所致。
2. 为了评估广泛转录对ecDA结构的影响，我们进行了酮肟辅助的ssDA测序（KAS-seq），以绘制全基因组范围内的ssDA。
3. 在根据输入进行归一化以考虑拷贝数差异后，我们观察到COLO20DM中的ecDA扩增子内KAS-seq读取密度比COLO20HSR增加了1.4倍（图1b,c）。
4. ecDA上的ssDA区域从数百到超过20,000个碱基对（bp），大多数KAS-seq峰值与转录区域重叠，例如注释的非编码转录本（长非编码RA、微小RA，60%）和GRO-seq鉴定的新转录本（18%；图1d,f和扩展数据图b）。
5. 综上所述，这些结果表明ecDA提供了一个允许广泛转录起始的染质环境，导致RA种类和ssDA的积累。

Para_01

1. 广泛转录在ecDA上增加了转录-复制冲突的可能性。
2. 当RA聚合酶II与DA复制机制发生碰撞时，复制叉的进展停滞，新核苷酸的掺入速度减慢，复制叉后面的单链DA暴露并被磷酸化的RPA2蛋白（pRPA2-S）结合，细胞经历复制压力（RS）（图2a）。
3. 这一假设预测，含有ecDA的癌细胞应该具有更高的DA RS，并且通过限制转录可以缓解RS。
4. 首先检查含有ecDA的原发肿瘤，我们根据WGS数据通过AmpliconArchitect1分析，将来自癌症基因组图谱（TCGA）肿瘤患者的肿瘤分为ecDA阳性组和ecDA阴性组。
5. 我们通过两个在参考文献中确定的基因表达特征计算了RS评分（RS评分1）和（RS评分2），发现使用这两种方法计算的ecDA阳性的肿瘤的RS评分显著更高（图2b和扩展数据图4a）。
6. 这一结果表明，增加的RS可能是ecDA+癌症的共同特征。
7. 接下来，转录和复制机制之间的冲突应导致复制叉进展速度变慢。
8. 我们将DA纤维分析与DA荧光原位杂交（FISH）相结合，分析了MYC扩增的同源COLO20DM与COLO20HSR细胞中的复制叉动力学。
9. 新生DA合成通过依次孵育胸腺嘧啶类似物IdU和CIdU进行标记。
10. 然后通过每个IdU/CIdU轨迹的长度计算复制叉的速度。
11. 我们观察到COLO20DM细胞的复制叉进展速率比COLO20HSR细胞慢；重要的是，胸腺嘧啶类似物掺入和MYC DA FISH的双重标记显示，ecDA的复制叉进展速率显著慢于染体上的相同序列（图2c）。

Fig. 2: Transcription–replication conflict creates RS on ecDAs.

• 描绘转录-复制冲突和 RS 的示意图。
• 根据 ecDA 放大状态分组的 TCGA 患者的 RS 得分 1（n: 22, 582）。
• 在 COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞中结合 MYC FISH 的 DA 纤维分析。测量了全局（中间）或 MYC 位点（右侧）的复制叉（RF）进展率（箱线图表示最小值到最大值；n: 48, 17, 14, 101）。
• 复制蛋白 A 磷酸化：pRPA2-S 免疫荧光（IF）结合 EGFR 或 MYC DA FISH 显示 ecDA 上更高的 RS（n: 70, 274, 99, 568, 209, 244）。
• pRPA2-S 免疫荧光（IF）结合 EGFR FISH，在加入 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）0 分钟后；细胞核用 DAPI 共染。左，代表性图像。第二左，每个 pRPA2-S 像素强度区间内共定位像素的比例（阴影表示中位数 ± 25% 四分位范围，n: 10, 6）。第二右，共定位焦点数量（n: 267, 194, 104, 75）。右，与 EGFR 共定位的 pRPA2-S 的百分比（n: 71, 269）。红点表示由 WGS 计数计算出的扩增子占基因组的比例。
• 比较不同 ecDA 含量的肿瘤细胞的 RS，按总 DA FISH 强度分组（GBM9ec，n: 111, 148, 111；COLO20DM，n: 282, 75, 282；PC: 6, 8, 6）。
• 突出显示在用雷公藤内酯或溶剂处理的 COLO20 细胞中 ecDA 区间内的两个区域的基因组轨迹。
• 雷公藤内酯（TPL）处理减少了 COLO20（h）和 GBM9（i）细胞中 ecDA 上的 RS（COLO20DM/HSR 细胞，n: 54, 50, 269, 10, 185, 161；GBM9ec/HSR 细胞，n: 19, 191, 264, 222）。
• 箱线图 b–i 表示中心线、中位数；限制，25–75 四分位数；须，1.5 倍四分位距或另有说明。d–f, h–i 以小提琴图和箱线图呈现。小提琴图轮廓表示核概率密度。P 值通过双侧 Wilcoxon 检验确定，除非图 2c 使用未配对的 Kolmogorov–Smirnov 检验。比例尺，10 µm（d（上行），e（左），h, i（上）），2 µm（d（下行），e（右），i（下）），50 kb（g（左）），200 kb（g（右））。

Para_02

1. 为了直接可视化单个肿瘤细胞中的复制应激（RS）并确定其核内定位，我们使用免疫荧光（IF）检测丝裂原活化蛋白激酶位点（serine ）上的RPA2蛋白磷酸化（pRPA2-S），这是一种复制应激的标志物。
2. 我们分析了包括三个近等基因细胞系对在内的多个细胞系中的pRPA2-S：COLO20DM/COLO20HSR（MYC扩增的结直肠癌），GBM9ec/GBM9HSR（EGFR扩增的胶质母细胞瘤）和PC-DM/PC-HSR（MYC扩增的前列腺癌）（扩展数据图1a-h），以及几个有或没有ecDA的其他细胞系。
3. 在每个近等基因细胞系对中，扩增的致癌基因是共享的，但其位置在ecDA上或染体/HSR上有所不同。
4. 我们发现在含有ecDA的肿瘤细胞中，pRPA2-S焦点比不含ecDA的肿瘤细胞高2到倍，表明含有ecDA的肿瘤细胞中的复制应激增加（扩展数据图4b）。

Para_0

1. 为了确定RS是否优先在ecDA上升高，我们对GBM9ec细胞进行了同时的DA FISH检测以识别ecDA扩增的致癌基因（EGFR）和IF检测以识别RS（pRPA2-S）。
2. 我们还加入了EdU标记以检测活跃复制的细胞。
3. 我们还在同源对照组GBM9HSR中检查了这些特征，其中扩增的EGFR在染体上的拷贝数相似（扩展数据图1d）。
4. 正如假设的那样，我们在GBM9ec肿瘤细胞中检测到显著更高的RS，通过pRPA2-S和EGFR FISH信号的共定位测量，与GBM9HSR肿瘤细胞相比，特别是在EdU阳性细胞中更为明显。
5. 值得注意的是，在pRPA2-S强度增加的像素中，观察到更高的共定位比率，总共有超过倍的更高比率在ecDA上，而不是在HSR上，这表明ecDA和HSR上的致癌基因之间存在特定的分子相互作用，而不仅仅是空间组织的差异（图2e）。
6. 在考虑了总的EGFR FISH信号后，我们继续观察到ecDA+细胞中EGFR的pRPA2-S信号增加，确认较高的RS在ecDA上，而不是染体扩增，不是由拷贝数差异驱动的（扩展数据图4c）。
7. 为了确定ecDA是否比基因组的其余部分经历更高的RS，我们量化了GBM9ec和GBM9HSR肿瘤细胞中总核pRPA2-S信号与EGFR共定位的百分比。
8. 根据WGS，ecDA约占GBM9ec细胞基因组含量的2%。
9. 因此，如果ecDA经历了与基因组其余部分相当水平的RS，我们预计它们将占总核pRPA2-S信号的类似比例。
10. 然而，我们发现总核pRPA2-S信号中有14.5%位于ecDA上，是7倍的富集。
11. 相比之下，GBM9HSR中与EGFR共定位的pRPA2-S的比例与扩增子的相对基因组含量相当（图2e）。
12. 这些发现表明，RS在ecDA上相对于基因组的其余部分优先增加。
13. 此外，结合pRPA2-S IF和DA FISH染在另外两个近同源细胞系对中进行的研究，这些细胞系包含MYC扩增，COLO20和PC，也显示了ecDA上的RS高于HSR（图2d和扩展数据图4c-e）。
14. 为了确认ecDA实际上是RS的驱动因素，我们根据致癌基因FISH强度将单个细胞按ecDA拷贝数分组，并比较了COLO20DM、GBM9ec和PC-DM细胞中具有最高0%、最低0%和中间40%致癌基因拷贝数的细胞中pRPA2S染的强度。
15. 我们发现在所有三个细胞系中，具有最高0% ecDA含量的细胞的RS显著高于具有最低0% ecDA含量的细胞（图2f）。
16. 我们在多种癌症细胞类型中的结果，无论扩增的致癌基因的身份如何，共同表明较高的RS是ecDA的一个常见特征（扩展数据图4b-e）。

Para_04

1. 已经证明，ecDA 具有更开放的染质、增加的转录和升高的复制应激（RS），我们着手确定 ecDA 上升高的 RS 是否是由于 ecDA 拓扑结构产生的普遍转录的直接且可能可操作的后果。
2. 我们用三萜类化合物处理了 COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞，该化合物通过与转录因子复合物 TFIIH 的 XPB 亚基结合来抑制转录起始。
3. 通过免疫荧光检测到的活性 RA 聚合酶 II 显示，三萜类化合物处理显著降低了转录活性（扩展数据图 5a）。
4. 在用三萜类化合物处理的 COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞中进行的 KAS-seq 分析显示，ecDA 扩增子上的单链 DA 信号显著减少（图 2g）。
5. 我们发现，三萜类化合物处理显著减少了 COLO20DM 细胞中的 pRPA2-S 焦点，而在 COLO20HSR 细胞中影响微乎其微（图 2h），这表明转录对 COLO20DM 细胞中的升高 RS 有贡献。
6. 在 GBM9 同源模型中，尽管 ecDA 和 HSR 细胞之间的扩增子广泛新转录相似，但我们观察到 GBM9ec 相对于 GBM20HSR 在特定区域有所诱导，包括位于 EGFR 癌基因位点内的内含子反义转录本 EGFR-AS1，导致趋同转录（扩展数据图 6a-c）。
7. 三萜类化合物处理 GBM9ec 细胞显著减少了通过联合 pRPA2-S 免疫荧光和 EGFR 荧光原位杂交检测到的 ecDA 上的 RS，而在 HSR 上未观察到明显差异（图 2i 和扩展数据图 5b）。
8. 此外，三萜类化合物处理仅减少了活跃复制的 Edu+ GBM9ec 细胞中的 pRPA2S 信号（扩展数据图 5b）。
9. 综上所述，我们的结果表明，ecDA 表现出比染体位点更高的 RS 水平，并且这种增加的 RS 主要是由同时发生的转录和复制驱动的（扩展数据图 5c,d）。

Para_01

1. RS 导致内源性 DA 损伤，因为停滞的复制叉不稳定且容易断裂，产生 DA 损伤。
2. 因此，我们假设含有 ecDA 的肿瘤细胞可能具有更高的 DA 损伤基线水平。
3. 我们使用两种 DA 损伤标志物测试了这一假设：γH2AX 标记所有双链 DA 断裂，5BP1 标记由前一个细胞周期 DA 复制过程中产生的未修复 DA 损伤，特别是在 G1 期子细胞中。
4. 在一组包含 ecDA 和不包含 ecDA 的癌细胞系中，包括三个近等基因细胞系对，我们发现除了有更多的 pRPA2-S 焦点外，ecDA+ 细胞的 γH2AX 和 5BP1 焦点数量平均高于相应的等基因 HSR 和/或其他 ecDA− 细胞系（图 a 和扩展数据图 7b,c）。
5. 在等基因细胞系对中结合 γH2AX 免疫荧光与 DA FISH 染确认了 ecDA 上的 DA 损伤增强，与染体扩增子相比（扩展数据图 7d,e）。
6. 为了进一步确认 ecDA 本身的 DA 损伤，我们在 COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞中进行了碱性彗星试验结合 MYC FISH 染，其中受损的 DA 出现在彗星的尾部区域。
7. 我们观察到 COLO20DM 细胞的彗星尾部区域中的 MYC 焦点显著多于 COLO20HSR 细胞（图 b），尽管它们具有相似的扩增子拷贝数。
8. 这些数据表明，相对于染体上相同位点的扩增，ecDA 上的 DA 损伤增加。
9. 因此，含有 ecDA 的癌细胞可能高度依赖 RS 调节机制来应对由转录-复制冲突驱动的高水平基线 DA 损伤。

Fig. : RS activated S-phase checkpoint and generated vulnerability to CHK1 inhibition in ecDA-containing tumour cells.

• a, 在具有不同 ecDA 扩增状态的多种癌细胞系中检测 pRPA2-S、γH2AX、pCHK1-S45 和 5BP1/细胞周期蛋白 A。左侧，COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞的代表性图像。右侧，各细胞系中的平均焦点数。线表示中位数；每个点表示每个细胞系中的平均焦点数。
• b, 在 COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞中进行彗星荧光原位杂交（Comet-FISH）测定。顶部，代表性图像。底部左，尾部的 MYC 焦点数。底部右，彗星尾部中 MYC 的百分比（双侧 Wilcoxon 检验，n: 47, 60, 49, ）。
• c, 随时间变化，转导靶向 CHK1 的 sgRAs 的 Hela ecDA+ 和 Hela ecDA− 细胞相对于转导非靶向（T）sgRA 的细胞的相对细胞数。
• d, SU16、COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞对 CHIR-124 的反应，在三天内的细胞活力曲线（n = 4，均值 ± 标准差）。
• e, 细胞经 CHIR-124 处理后，在指定时间进行 TUEL 测定（均值 ± 标准差，单因素方差分析与多重比较检验，n = ）。
• f, COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞经 CHIR-124 处理，有或没有 CDC7i（XL41）组合处理，并加入 EdU 0 分钟后的 γH2AX 免疫荧光测定。左侧，代表性图像；红线条标记 EdU+ 和白线条标记 EdU− 细胞核。右侧，γH2AX 强度（任意单位）。EdU−，n: ,074, 4,246, ,291, 4,742, ,101, ,770, 2,608, 2,091；EdU+，n: 2,428, 2,859, 2,909, 2,890, ,46, ,491, ,22, 2,060；双尾 Student t 检验。
• g, 描述了在 RS 反应中 CHK1 的激活，这通过未计划的复制起点启动和过度的 DA 损伤积累，使含有 ecDA 的肿瘤细胞对靶向 CHK1i 敏感，导致细胞死亡。箱形图 b 和 f 以及小提琴图 f 的参数与图 2 相同或另有说明。比例尺，10 µm（a,e,f），20 µm（b）。a.u.，任意单位。

Para_01

1. 我们认为，这种对 ecDA 携带肿瘤细胞中的 RS 调控机制的高度依赖可能会产生可利用的弱点。
2. 为了应对停滞的复制叉，细胞会使用一种称为 S 期检查点的信号级联反应，以确保当 DA 尚未完全复制时，细胞不会进入有丝分裂。
3. 检查点激酶 1 (CHK1) 是该检查点途径的核心节点，当检查点被激活时会被磷酸化。
4. 我们通过免疫荧光检测到，与相应的同源 HSR 细胞相比，ecDA 含有的肿瘤细胞中 pCHK1-S45 表达更高（图 a 和扩展数据图 7a），这表明 ecDA 上的转录-复制冲突导致了 ecDA 含有的肿瘤细胞中 S 期检查点的激活。
5. 在没有功能性检查点的情况下，高度受损的 DA 细胞会继续通过细胞周期，导致细胞死亡。
6. 因此，我们假设由于内在的高度 RS，ecDA 含有的肿瘤细胞将高度依赖于 CHK1 来管理 DA 损伤，而 CHK1 抑制 (CHK1i) 可能会在 ecDA 含有的肿瘤细胞中引发选择性细胞死亡。

Para_02

1. 为了验证这一假设，我们使用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）敲除了在含有或不含ecDA的HeLa细胞系中的CHK1基因。
2. 针对CHK1的两种不同的单引导RA（sgRA）在不同时间点上，在ecDA+ HeLa细胞中诱导了2到倍的生长抑制，而ecDA− HeLa细胞则没有这种效果（图c）。
3. 接下来，我们使用CHIR-124药理学抑制CHK1，发现含有ecDA的肿瘤细胞对CHK1抑制剂（CHK1i）比相应的同源HSR细胞更敏感，COLO20HSR细胞的半最大抑制浓度（IC50）比COLO20DM细胞高约4倍（图d）。
4. 通过三种结构不同的CHK1抑制剂——GDC-0575、SRA77和CHIR-124——进一步证实了含有ecDA的肿瘤细胞对CHK1抑制的敏感性，而检查点激酶2（CHK2）抑制剂CCT2415在ecDA+和ecDA−同源细胞系之间没有显示出差异性的抑制效果（扩展数据图8a-e）。
5. 更重要的是，CHK1i对细胞生长的抑制是通过诱导细胞死亡实现的，因为在用CHIR-124处理的含有ecDA的肿瘤细胞中观察到了更快和更高程度的细胞凋亡，这通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUEL；图e）和PI-Annexin V染（扩展数据图8f）检测得到。

Para_0

1. 作为 S 期检查点的主要效应器，CHK1 的激活通过限制细胞周期进展、限制晚期复制起点的激发以防止过多的 DA 损伤积累，并保护停滞的复制叉来维持细胞活力。
2. γH2AX 免疫荧光结合 EdU 标记显示，在用 CHIR-124 处理的 COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞中，CHK1 抑制剂诱导的 DA 损伤在 COLO20DM 细胞中显著高于 COLO20HSR 细胞，特别是在 S 期细胞中，如 EdU+ 染所示，这与 CHK1 在复制中的功能一致（图 f）。
3. 此外，CDC7 抑制剂（XL41）抑制复制起点的激发，表现为 EdU− 染强度降低（扩展数据图 8g），部分阻断了由 CHK1 抑制剂引起的 DA 损伤（图 f），表明 CHK1 抑制剂通过非计划的复制起点激发部分导致广泛的复制应激和 DA 损伤。
4. 进一步地，通过结合 pRPA2-S 免疫荧光和 MYC 荧光原位杂交，我们发现 COLO20DM 细胞对 CHK1 抑制剂的敏感性增加与 ecDA 拷贝数无关（扩展数据图 8h）。

Para_04

1. 综合起来，我们的发现表明转录-复制冲突、复制压力和增加的基础水平DA损伤是ecDA的常见特征，并驱动S期检查点的激活。
2. 针对ecDA+细胞的CHK1抑制剂会导致未计划的复制起点激发和DA损伤的积累。
3. 此外，高水平的转录-复制冲突和复制压力使得ecDA+细胞相对于ecDA−细胞对CHK1抑制剂具有选择性脆弱性，这为有效的ecDA定向提供了可能（图g）。

Para_01

1. 尽管有令人信服的临床前数据和单药初步证据，目前还没有任何癌症适应症批准的 CHK1 抑制剂。
2. 先前的 CHK1 抑制剂存在的一些局限性包括效力不足、潜在的脱靶风险（例如，CHK2），以及与 DA 损伤化疗联合使用时的重叠毒性。
3. 为了进一步研究 CHK1i 作为 ecDA+ 癌症的潜力，我们推进了 BBI-2779，这是一种口服生物利用度高、强效且选择性的 CHK1 小分子抑制剂（图 4a）。
4. BBI-2779 对 CHK1 的效力通过体外生化酶抑制和细胞生物标志物测定得到了确认。
5. BBI-2779 对 CHK1 的生化抑制 IC50 被发现为 0. nM，而在肿瘤细胞中观察到 RS 的细胞诱导（通过 pCHK1-S45 判断，由于上游激酶对 CHK1 的磷酸化）为 nM。
6. 与测试的其他口服生物利用度高的 CHK1 抑制剂相比，BBI-2779 具有更优的生化和选择性细胞生长抑制作用（ecDA+ CellTiter-Glo 增殖的 IC50 高出约 18-168 倍）（表 1）。
7. 该抑制剂对 CHK1 的选择性超过 160 倍，表明其具有较高的药理学特异性（表 1）。
8. BBI-2779 还表现出优异的生物利用度（%F = 71）和良好的啮齿动物暴露量，口服给药后可实现稳健的 CHK1 目标覆盖（表 2 和扩展数据图 9）。

Fig. 4: Oral CHK1i in combination with a pan-FGFRi demtrates synergistic antitumour activity and inhibits acquired resistance to targeted therapy manifested by ecDA.

• a, 化合物 BBI-2779 的化学结构。
• b,c, 通过 IF (b) 和免疫印迹 (c) 测量磷酸化 RPA2 Ser8 水平来检测 RS 及其相关生物标志物的剂量依赖性诱导。
• 对于 b，使用普通双因素方差分析确定显著性，n = 。
• d, BBI-2779 在 COLO20DM 和 HSR 细胞中的抗增殖活性差异（n = ）。
• e, 嵌入的 SU16 细胞 FISH 图像显示 FGFR2+ ecDA。SU16 细胞在小鼠中作为肿瘤异种移植生长。肿瘤建立后（约 285 mm³），小鼠分别接受载体、BBI-2779（0 mg/kg）、infigratinib（15 mg/kg）或 BBI-2779（0 mg/kg）加 infigratinib（15 mg/kg） 25 天（载体组）或 27 天（其他组）。显示各组平均肿瘤体积 ± 标准误（每组 n = 8 只小鼠）。
• f, 通过定量聚合酶链反应（qPCR）对肿瘤 DA 进行 FGFR2 基因拷贝数评估。通过单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验确定显著性。
• g, 肿瘤裂解物的免疫印迹显示 RS 升高、DA 损伤和致癌蛋白 FGFR2 表达的抑制（每组 n = /8 只小鼠）。
• h, ecDA 放大的致癌基因过度转录，导致 RS 升高并依赖于 CHK1 来管理 DA 复制以维持致癌蛋白的过表达和增殖。CHK1 抑制剂导致不受控制的起始点激发和细胞周期检查点失败，加剧了 ecDA 介导的肿瘤细胞中的 RS。在 ecDA+ 放大致癌基因的肿瘤细胞中，CHK1 抑制剂的合成致死效应与靶向协同作用，增强了细胞毒性。比例尺，10 µm。PO，口服；QD，每日一次；Q2D，隔日一次。来源数据

Table 1 In vitro and cellular potency of BBI-2779 and of reference compounds 表1 BBI-2779和参考化合物的体外和细胞效力

Table 2 Pharmacokinetic parameters of BBI-2779 indicate that it is well tolerated in mice 表2 BBI-2779的药代动力学参数表明其在小鼠中耐受性良好

Para_02

1. 由于 ecDA+ 肿瘤细胞携带升高的内在复制应激（RS），并对其他 CHK1 抑制剂敏感（图 d），我们假设它们对 BBI-2279 也会高度敏感。
2. 与这一假设一致，BBI-2779 处理 COLO20DM 细胞导致 RS 生物标志物 pRPA2-S8 的表达显著增加，且呈剂量依赖性，而 COLO20HSR 细胞则没有这种变化（图 4b）。
3. COLO20DM 细胞还表现出 pCHK1-S45 和 γH2AX 的剂量依赖性增加，这通过 Western 印迹法确定（图 4c）。
4. BBI-2779 诱导的 RS 在浓度依赖性上与 COLO20DM 细胞中的增强细胞毒性直接相关，与 COLO20HSR 细胞相比，IC50 值相差约 10 倍，表明在 ecDA+ 背景下存在合成致死性（图 4d）。

Para_0

1. 对 ecDA 上扩增的癌基因蛋白产物施加靶向压力会导致癌细胞逃避这种压力，要么通过增加主要致癌驱动因子的 ecDA 扩增（扩展数据图 10a-d），要么通过新的旁路癌基因的 ecDA 扩增。
2. 因此，我们研究了将靶向与 CHK1 抑制剂联合应用于 ecDA 扩增的肿瘤细胞是否能产生协同效果，导致癌细胞死亡和肿瘤消退。
3. 在 FGFR2 扩增的 ecDA+ 胃癌 SU16 异种移植瘤模型中，评估了 BBI-2779 与泛 FGFR 酪氨酸激酶抑制剂 infigratinib 联合使用的协同抗肿瘤活性和药效学。

Para_04

1. 单药 BBI-2779 或 infigratinib 导致肿瘤生长显著延迟，与对照组相比，在第 25 天的平均肿瘤生长抑制率分别为 64% 和 97%（P < 0.05 和 P < 0.0005）（图 4e）。
2. SU16 肿瘤细胞在体外和 SU16 异种移植肿瘤在体内的长期 infigratinib 导致肿瘤细胞停滞 1-2 周，随后对 infigratinib 产生耐药性，并伴随 ecDA 上 FGFR2 扩增增加，重新开始肿瘤生长（图 4f 和扩展数据图 10a-c）。
3. 单独使用 infigratinib 观察到的抗肿瘤活性不足或不持久，这与在 FGFR1/2/ 放大背景下报道的泛 FGFR 抑制剂缺乏临床疗效一致。
4. FGFR2 基因扩增增加与 FGFR2 蛋白水平相关，可能超过了小鼠最大耐受剂量下的 infigratinib 暴露量（图 4g 和扩展数据图 10d）。
5. BBI-2779 加 infigratinib 联合与对照组相比，导致显著的肿瘤生长抑制（P < 0.0001），在整个研究期间观察到肿瘤消退，这直接与单药 infigratinib 诱导的 ecDA 上进一步（适应性）FGFR2 癌基因拷贝数扩增的抑制相关（图 4e,f）。
6. 如预期的那样，单药 BBI-2779 和 BBI-2779 加 infigratinib 联合均导致 pCHK1-S45 和 pRPA2-S8 的肿瘤表达增强，而对照组肿瘤则没有这种变化（图 4g）。
7. 总之，这些发现表明，通过将选择性的 CHK1 抑制剂与针对放大驱动癌基因蛋白产物的靶向相结合，可以协同抗肿瘤活性，从而减弱 ecDA 介导的耐药性。
8. 由选择性 CHK1 抑制剂引起的不受控制的起源点激活严重破坏了高转录 ecDA 模板上的癌基因表达，从而使癌基因依赖的肿瘤细胞对 FGFR 抑制高度敏感（图 4h）。

Para_01

1. ecDA 是肿瘤进化的恶毒驱动因素，因为它是一个大规模癌基因表达和快速基因组适应的平台。
2. 在这里，我们展示了 ecDA 的转录优势可以被逆转，从而选择性地靶向含有 ecDA 的肿瘤。
3. ecDA 的增加转录不仅限于蛋白质编码癌基因位点，还扩展到 ecDA 贯穿的多个非编码基因间区和反义区域，这意味着基因方向性和复制起点在基因组中的进化配置被破坏。
4. 广泛的转录起始与 ecDA 上的染质可及性增加和增强子-启动子接触的随意性一致。
5. 因此，ecDA 的广泛转录导致了癌症细胞必须管理的转录-复制冲突增加的代价。
6. 先前的研究已将 DA 损伤与含有 ecDA 的癌症主要关联起来，作为 ecDA 生成的来源。
7. 我们的结果显示，一旦形成，ecDA 本身成为 DA 损伤的主要驱动因素。
8. RA 转录和 DA 复制机器是两个沿 DA 运行的过程性全酶；它们必须轮流运行或面临碰撞的风险。
9. 我们的发现表明，ecDA 上的并发转录和复制显著增加了 DA 损伤，癌症细胞变得严重依赖于 S 期 CHK1 来限制起源点的激活。
10. 对于癌症细胞来说，另一种选择是限制 ecDA 转录，从而失去癌基因过度表达，削弱它们独特的致癌和适应性生长优势。
11. ecDA 在复制速率或起源点激活方面的差异也可能导致其复制应激增加，这应在未来的研究中进行探讨。
12. 值得注意的是，由于复制应激导致的 ecDA 上 DA 损伤水平升高可能进一步推动 ecDA 本身的进化。
13. 然而，随着时间的推移，驱动 ecDA 突变的机制可能有很多，包括 ecDA+ 癌症中某些 DA 损伤修复途径的差异表达和 APOBEC 介导的突变增加。
14. 我们的研究仅对有限数量的细胞系模型进行了机制研究和潜在间接效应的考察。
15. 由于编码在 ecDA 上的癌基因（如 MYC、EGFR）驱动转录和细胞复制，ecDA 可能通过间接方式在整个基因组中促进转录-复制冲突。
16. 尽管如此，ecDA 的直接和间接效应都突显了转录-复制冲突作为 ecDA+ 癌症机会的重要性。

Para_02

1. 我们测试了增强转录-复制冲突将导致含有ecDA的肿瘤细胞自毁的概念。
2. CHK1的抑制显著增加了DA复制过程中ecDA的损伤，并导致选择性杀死含有ecDA的癌细胞。
3. 目前尚无批准用于癌症患者的CHK1抑制剂。
4. 尽管有令人信服的临床前数据和初步证据表明CHK1i单药具有临床活性，但缺乏预测性生物标志物和最佳的临床开发策略。
5. 此外，成功开发CHK1抑制剂的主要挑战之一是缺乏可靠的方法来识别预测对CHK1i高度敏感的高RS肿瘤。
6. 体内CHK1i的长期耐久性可能是利用非计划的DA复制确保癌细胞死亡所必需的。
7. 这里展示的结果表明，针对含有ecDA的癌症的下一代CHK1抑制剂是一种有前景的策略。
8. 值得注意的是，CHK1i与靶向阻断ecDA致癌基因编码的蛋白质产物显示出协同作用，并防止了适应性升高的ecDA拷贝数，这以前阻碍了针对扩增致癌基因蛋白产物的单药疗法。
9. 以往在癌症中的成功利用了癌症特异性细胞缺陷的合成致死性，例如在BRCA2缺陷的癌细胞中使用PARP抑制剂。
10. 我们的工作证明了利用癌症特异性细胞过剩的合成致死性的可行性，从而将ecDA在癌症中的分子优势转变为对其自身的打击。

Antibodies and reagents

抗体和试剂

Antibodies

抗体

Para_01

1. 抗体从以下来源获得：HK6me（Abcam，产品编号 ab9050），γH2AX（Millipore，产品编号 05-66 用于免疫荧光），γH2AX（Cell Signaling Technology，产品编号 CST9718 用于 Western blot），pRPA2S（ovus Biological，产品编号 B100-544），pCHK1S45（Invitrogen，产品编号 PA5-4625），5BP1（ovus Biological，产品编号 B100-04），cyclin A（BD Biosciences，产品编号 611268），pRAPII S2/S4（Abcam，产品编号 ab252855），pCHK1-S45（Cell Signaling Technology，产品编号 CST248），CHK1（Abcam，产品编号 ab251），pRPA2/RPA2-Ser8（Cell Signaling Technology，产品编号 54762 S），Vinculin（Cell Signaling Technology，产品编号 CST1901），pFGFR2-Tyr65/654（Cell Signaling Technology，产品编号 CST476S）和 FGFR2（Cell Signaling Technology，产品编号 CST1185S）。

Chemicals

化学品

Para_01

1. 化学品从以下供应商处采购：CHIR-124（Selleckchem，目录号 S268），XL41（Selleckchem，目录号 S7547）和雷公藤内酯（Millipore，目录号 645900-5MG）。

Cell culture

细胞培养

Para_01

1. GBM9ec、GBM9HSR 和 HK296 是患者来源的神经球细胞系，建立方法如前所述。
2. 亲本 PC 细胞系购自 ATCC。
3. PC DM 和 PC HSR 细胞系由 Mischel 实验室通过单细胞扩增从亲本 PC 细胞系中分离出来，并可向 Mischel 实验室申请获取。
4. 所有其他细胞系均购自 ATCC。
5. 人前列腺癌细胞系 PC DM、PC HSR；结直肠癌细胞系 COLO20DM、COLO20HSR；胃癌细胞系 SU16；肺癌细胞系 PC9 和 hTERT 永生化视网膜素上皮细胞系 RPE1 均在含有 10% 胎牛血清（FBS；Gibco）的 4.5 g/L 葡萄糖配方的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（Corning）中培养。
6. 对于 GRO-seq 和 ChIP-seq，COLO20DM 和 COLO20HSR 在含有 10% FBS 的 Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基（含 GlutaMAX；Gibco）中生长。
7. GBM9ec、GBM9HSR 和 HK296 细胞系在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/F12（Gibco，目录号 1120-0）中培养，补充有 1× B27（Gibco，目录号 17504-01）、20 ng/ml 表皮生长因子（Sigma，目录号 E9644）、20 ng/ml 成纤维细胞生长因子（Peprotech，目录号 AF-100-18B）、1–5 µg/ml 肝素（Sigma，目录号 H149）和 1× GlutaMAX（Gibco，目录号 5050-061）。
8. 用于测序实验的 GBM9 细胞在没有额外添加 GlutaMAX 的条件下培养。
9. 所有细胞均在 7 °C、5% CO2 的湿润培养箱中维持培养。
10. 细胞系常规检测未发现支原体污染。

GRO-seq

GRO-seq（全称Global Run-On sequencing）是一种用于检测活跃转录区域的高通量测序技术。

Para_01

1. COLO20DM 和 COLO20HSR 的 RA 是通过用冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞，然后加入冰冷的 LB（10 mM Tris-HCl pH 7.4, 2 mM MgCl2, mM CaCl2, 0.5% IGEPAL-CA60, 10% 甘油, 1 mM DTT, 蛋白酶抑制剂 (Roche, 目录号 1186170001), Rase 抑制剂 (Ambion, 目录号 AM2696)），并将细胞刮入 15 ml 圆锥管中制备的。
2. 细胞在 4 °C 下以 1,000g 离心 10 分钟。上清液被移除，沉淀物用宽口吸头彻底重悬于 1 ml LB 中。再加入 9 ml LB，然后在 4 °C 下以 1,000g 离心 10 分钟。细胞在 LB 中重悬并离心。沉淀物用冰冷的冷冻缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8., 5 mM MgCl2, 40% 甘油, 0.1 mM EDTA, 每毫升冷冻缓冲液 0.2 μl Rase 抑制剂）重悬，并在 4 °C 下以 2,000g 离心 2 分钟。每 5 百万个细胞的核用 100 μl 冷冻缓冲液重悬。
3. 准备了一个核跑带主混合液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 00 mM KCl, 0.5 mM ATP, 0.5 mM GTP, 0.00 mM CTP（未标记的核糖核苷三磷酸来自 Roche, 目录号 11277057001），0.5 mM 溴尿苷三磷酸 (Sigma, 目录号 B7166)，1% 十二烷基肌氨酸钠，每 100 μl 加 1 μl Rase 抑制剂），并预热至 0 °C。将等体积的主混合液加入到分装的核中（每个重复 5 百万个核），并在 0 °C 下轻柔摇动孵育 5 分钟。使用 RQ1 Dase I 和 RQ1 缓冲液 (Promega, 目录号 M610A) 在 7 °C 下进行 0 分钟的 Dase 消化；反应通过加入终止缓冲液至最终浓度为 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% 十二烷基硫酸钠 (SDS), 5 mM EDTA, 1 mg/ml 蛋白酶 K 来停止。样品在 55 °C 下孵育 1 小时。加入 aCl 至最终浓度为 225 mM。进行了两次酚-氯仿提取，随后进行一次氯仿提取。RA 在 75% 乙醇和 1 μl 聚糖蓝 (Ambion, 目录号 9516) 中在 -20 °C 下过夜沉淀。

Para_02

1. 对于 GBM9ec 和 GBMHSR，细胞用冰冷的 PBS 洗涤，然后在 4°C 下以 500g 离心 5 分钟。
2. 然后将细胞重悬于 10 ml 冰冷的膨胀缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，2 mM MgCl2， mM CaCl2，蛋白酶抑制剂，Rase 抑制剂）中，并在冰上孵育 5 分钟。
3. 细胞在 4°C 下以 400g 离心 10 分钟，然后重悬于 10 ml 冰冷的甘油膨胀缓冲液（0.9× 膨胀缓冲液，10% 甘油）中。
4. 在摇动试管的同时，缓慢加入 10 ml 冰冷的裂解缓冲液（甘油膨胀缓冲液，1% IGEPAL-CA60）。
5. 样品在冰上孵育 5 分钟，然后加入另外 25 ml 裂解缓冲液，样品在 4°C 下以 600g 离心 5 分钟。
6. 样品重悬于冰冷的冷冻缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，5 mM MgCl2，40% 甘油，0.1 mM EDTA，Rase 抑制剂）中，并在 4°C 下以 900g 离心 6 分钟。
7. 向分装的核（每重复 1000 万个核）中加入等体积的预热核转录主混合液，并在 0°C 下轻轻摇动孵育 7 分钟。
8. 然后将样品彻底混匀于 600 μl Trizol LS 中，并在室温下孵育 5 分钟。
9. 接下来，向每个样品中加入 160 μl 氯仿，剧烈摇动，然后在室温下孵育 分钟，并在 4°C 下以 12,000g 离心 0 分钟。
10. 向水相中加入 aCl 至最终浓度为 00 mM，RA 在 75% 乙醇中与 1 μl glycoblue 一起在 -20°C 下过夜沉淀。

Para_0

1. 对于所有细胞类型，在过夜RA沉淀后，RA在4°C下以21,10g离心20分钟。
2. RA沉淀物用新鲜的75%乙醇洗涤，短暂风干，然后溶解于20 μl水中。
3. 碱水解使用5 μl 1 aOH进行10分钟，然后用25 μl 1 M Tris-HCl（pH 6.8）中和。
4. 使用P0 Micro柱（Bio-Rad，目录号726250）进行缓冲液交换，然后用RQ1 Dase I和RQ1缓冲液处理，并在7°C下孵育（COLO20为10分钟，GBM9为0分钟）。
5. 再次进行缓冲液交换。
6. 每个样品加入 μl T4多核苷酸激酶（PK；ew England Biolabs，目录号M0201），1× PK缓冲液，2 μl 10 mM ATP和2 μl Rase抑制剂，并在7°C下孵育1小时。
7. 每份样品再加入2 μl PK，并继续孵育0-60分钟。
8. 通过加入氯化铵（最终浓度50 mM）、泊洛沙姆188（最终浓度0.1%）、2 μl信使RA脱帽酶（ew England Biolabs，目录号M0608S）和1 μl Rase抑制剂，在7°C下孵育0分钟来完成RA脱帽。
9. 然后加入EDTA至最终浓度25 mM，并将样品在75°C下孵育5分钟。
10. 样品随后在冰上孵育至少2分钟。
11. 然后用结合缓冲液（0.25× SSPE，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，7.5 mM aCl，Rase抑制剂）将样品体积调整到100 μl。
12. 在T4 PK处理期间，每份样品用60 μl抗BrdU琼脂糖珠（Santa Cruz Biotechnology，目录号sc-22ac）在500 μl结合缓冲液中旋转5分钟以平衡，离心并再次用结合缓冲液洗涤。
13. 珠子在封闭缓冲液（1×结合缓冲液，0.1%聚乙烯吡咯烷酮，1 μg/ml超纯牛血清白蛋白（BSA），Rase抑制剂）中旋转1小时以封闭，室温下进行。
14. 然后用结合缓冲液洗涤珠子两次，并重新悬浮于400 μl结合缓冲液中。
15. 将脱帽的RA加入封闭的珠子中，并在室温下旋转1小时。
16. 然后用结合缓冲液洗涤珠子一次，用低盐缓冲液（0.2× SSPE，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，Rase抑制剂）洗涤一次，用高盐缓冲液（0.2× SSPE，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，17.5 mM aCl，Rase抑制剂）洗涤一次，每次旋转分钟，最后用Tris-EDTA-Tween20缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，Rase抑制剂）洗涤两次。
17. 所有含有琼脂糖珠的离心均在室温下以1000g离心2分钟，所有洗涤均在500 μl缓冲液中旋转5分钟，除非另有说明。
18. 样品在预热至42°C的洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mM DTT，1 mM EDTA，150 mM aCl，0.1% SDS，Rase抑制剂）中洗脱；在42°C下进行四次10分钟的洗脱，期间定期涡旋。
19. 每个重复的洗脱液合并，然后通过酚氯仿和氯仿沉淀（COLO20）或使用ew England Biolabs Monarch RA Cleanup Kit T200（GBM9）柱纯化RA。
20. 使用EBext Small RA Library Prep Kit（ew England Biolabs，目录号E70）制备测序文库，并由ovaseq PE150进行测序。
21. 使用STAR v.2.7.10b将序列数据映射到人类参考基因组（hg8）。
22. 使用HOMER v.4.11.1在每个链上分别进行从头转录本鉴定，使用默认的GRO-seq设置。
23. 使用SAMtools v.1.8过滤MAPQ值小于10的读段。
24. 使用picard-tools去除重复读段。
25. 使用deepTools bamCoverage v...1将GRO-seq信号转换为bigwig格式以便可视化，参数如下：--binSize 10 --normalizeUsing CPM --effectiveGenomeSize 209286105 --exactScaling。

Total RA library preparation

总RA文库制备

Para_01

1. 从每个样本中使用 Quick-RA Miniprep Kit (Zymo Research, 目录号 R1054) 分离总 RA，输入细胞数为 1-2 百万个。
2. 使用 TruSeq Stranded Total RA Library Prep Kit with Ribo-Zero (Illumina, 目录号 20020596) 构建 RA 文库。
3. extseq 550 测序系统 (Illumina) 每个样本产生 20-0 百万对端测序读段，读长为 75 bp。
4. 使用 STAR, v.2.7.10b 将序列数据映射到人类参考基因组 hg8，遵循 ECODE RA-seq 管道。
5. 使用 SAMtools (v.1.8) 过滤 MAPQ 值小于十的读段。
6. 使用 deepTools bamCoverage (v...1) 将 Ribo-Zero 信号转换为 bigwig 格式以便可视化，参数如下：--binSize 10 --normalizeUsing CPM --effectiveGenomeSize 209286105 --exactScaling。

KAS-seq library preparation

KAS-seq 文库制备

Para_01

1. KAS-seq 实验按照先前描述的方法进行，但有所修改。简而言之，在细胞培养基中补充了 5 mM -酮醛（最终浓度），并将细胞在六孔板中 7 °C 孵育 10 分钟。
2. 然后使用 Monarch gDA 纯化试剂盒（EB T010S）提取基因组 DA，遵循标准协议，但用 50 µl 25 mM KBO（pH 7.0）洗脱。
3. 点击反应通过混合 87.5 µl 纯化的 DA、2.5 µl 20 mM DBCO-PEG4-生物素（二甲基亚砜溶液，Sigma，目录号 760749）和 10 µl 10× PBS 在最终体积为 100 µl 的条件下进行。反应在 7 °C 下孵育 90 分钟。
4. DA 使用 AMPure XP 磁珠纯化，每 100 µl 反应加入 50 µl 磁珠，磁力架上用 80% 乙醇洗涤两次，然后在 10 µl 25 mM KBO 中洗脱。纯化的 DA 使用 Covaris E220 仪器剪切成约 200–400 bp 的大小。
5. 生物素标记的 DA 的下拉实验通过将 10 µl 10 mg ml−1 Dynabeads MyOne Streptavidin T1 磁珠（Life Technologies，目录号 65602）在磁力架上分离，并用 180 µl 1× Tween 洗涤缓冲液（TWB；5 mM Tris-HCl pH 7.5；0.5 mM EDTA；1 M aCl；0.05% Tween 20）洗涤来启动。磁珠重新悬浮在 00 µl 2× 结合缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA，2 M aCl）中，超声处理的 DA 被加入（如有必要，稀释至最终体积为 00 µl），并在室温下在旋转器上孵育至少 15 分钟。磁珠在磁力架上分离，用 00 µl 1× TWB 洗涤，并在 Thermomixer 中以 1,000 rpm 的速度在 55 °C 下加热 2 分钟。在磁力架上移除上清液，并重复 TWB 洗涤和 55 °C 孵育步骤。

Para_02

1. 使用 EBext Ultra II DA 文库制备试剂盒（EB，货号 E7645）在珠子上制备文库。
2. 首先，在 20°C 下，在 50 µl 1× EB 缓冲液中加入 µl EB Ultra 末端修复酶和 7 µl EB Ultra 末端修复酶，将珠子在 Thermomixer 中以 1,000 rpm 振荡 0 分钟进行末端修复。
3. 然后在 65°C 下孵育 0 分钟。
4. 其次，通过加入 2.5 µl EB 适配器、1 µl 连接增强剂和 0 µl 平末端连接混合物，在 20°C 下孵育 20 分钟，然后加入 µl USER 酶并在 7°C 下孵育 15 分钟（在 Thermomixer 中以 1,000 rpm 振荡）。
5. 将珠子放在磁力架上分离，并在 55°C 和 1,000 rpm 下用 180 µl TWB 洗涤 2 分钟。
6. 磁性分离后，用 100 µl 0.1× TE 缓冲液洗涤珠子，将其重悬于 15 µl 0.1× TE 缓冲液中，并在 98°C 下加热 10 分钟。
7. 通过加入 5 µl i5 和 i7 EBext 测序适配器各 5 µl 以及 25 µl 2× EB Ultra PCR Master Mix 进行 PCR，先在 98°C 下孵育 0 秒，然后进行 15 个循环：98°C 10 秒，65°C 0 秒，72°C 1 分钟，最后在 72°C 下孵育 5 分钟。
8. 将珠子放在磁力架上分离，并使用 1.8 倍体积的 AMPure XP 珠子清理上清液。

Para_0

1. 文库使用 Illumina extSeq 仪器和 extSeq 550 高通量试剂盒（2 × 6 循环）以配对末端格式测序。
2. 序列数据使用 Bowtie 映射到人类基因组的 hg8 组装，参数设置如下：-v 2 -k 2 -m 1 --best --strata -X 1000。
3. 使用 picard-tools（v.1.99）去除重复读段。
4. 使用 MACS2（v.2.1.1）进行峰检测，参数设置如下：--broad -g hs --broad-cutoff 0.01 -q 0.01。
5. 浏览器轨迹是在使用 bamCompare 默认设置归一化到输入后生成的。

ChIP–seq library preparation

ChIP–seq文库制备

Para_01

1. 每份重复样本用00万个细胞，在室温下旋转固定于1%甲醛中15分钟，然后用0.125 M甘氨酸在室温下旋转淬灭10分钟。
2. 固定的细胞在4°C下以1,00g离心5分钟，并用冷PBS洗涤两次后储存于-80°C。
3. 膜裂解在5 ml LB1（50 mM HEPES pH 7.5，140 mM aCl，1 mM EDTA，10%甘油，0.5% IPEGAL-CA60，0.25% Triton X-100，Roche蛋白酶抑制剂1186170001）中进行，4°C下旋转10分钟。
4. 核在4°C下以1,400g离心5分钟，然后在5 ml LB2（10 mM Tris-Cl pH 8.0，200 mM aCl，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，Roche蛋白酶抑制剂）中裂解，室温下旋转10分钟。
5. 染质在4°C下以1,400g离心5分钟，然后在1 ml TE缓冲液加0.1% SDS中重悬，使用Covaris E220进行超声处理，设置如下：140 W，10%占空比，每次脉冲200个循环，每个样本600秒。
6. 样品通过在4°C下以16,000g离心10分钟澄清。
7. 上清液转移到新管中，并用两倍体积的IP稀释缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，200 mM aCl，1 mM EGTA，0.2% a-DOC，1% a-laurylsarcosine，2% Triton X-100）稀释。
8. 每份样品保留50 µl剪切的染质作为输入，使用7.5 µg HK6me抗体（ab9050）（1:00稀释）在4°C下旋转过夜进行ChIP。
9. 每份样品使用100 μl蛋白A磁珠，用1 ml预冷的封闭缓冲液（0.5% BSA在PBS中）洗涤三次，然后加入染质，在抗体过夜孵育后，4°C下旋转4小时。
10. 样品用1 ml预冷的洗涤缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，500 mM LiCl，1 mM EDTA，1% IPEGAL-CA60，0.7% a-DOC）洗涤五次，然后用1 ml预冷的TE + 50 mM aCl洗涤。
11. 样品在65°C下用洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，10 mM EDTA，1% SDS）洗脱。加入aCl至最终浓度为455 mM。
12. 样品在55°C下与0.2 mg ml−1蛋白酶K孵育1小时，然后在65°C下过夜去交联。
13. 样品用0.2 mg ml−1 RA酶在7°C下处理2小时，然后使用Zymo ChIP DA Clean & Concentrator Kit（D2505）纯化。
14. 文库使用EBext Ultra II DA Library Prep Kit（E7645）制备，并通过ovaSeq PE150测序。
15. 序列数据使用Trimmomatic22（v.0.6）去除接头，然后使用Bowtie2映射到人类基因组的hg8组装，设置如下：--local --very-sensitive --phred -X 1000。
16. 使用SAMtools（v.1.8）过滤MAPQ值小于10的读段，使用picard-tools去除重复读段。
17. CHIP–seq信号使用deepTools bamCoverage18（v...1）转换为bigwig格式以便可视化，参数如下：--binSize 10 --normalizeUsing CPM --effectiveGenomeSize 209286105 --exactScaling。

IF and DA FISH staining

免疫荧光和DA荧光原位杂交染

Para_01

1. 盖玻片用 100 μg ml−1 聚-l-赖氨酸过夜或 10 μg ml−1 层粘连蛋白在 7 °C 下孵育 1 小时后进行细胞接种。
2. 非同步细胞被接种到载玻片上，并接受不同的处理。
3. 如需标记，EdU 在收集样品前 0 分钟以 10 μg ml−1 的浓度加入每个孔中。
4. 免疫荧光（IF）和双重免疫荧光 DA FISH 染按照先前描述的方法进行。
5. 简而言之，载玻片用冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟，然后在室温下用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 渗透 15 分钟。
6. 样品在室温下用含 % BSA 的 PBS 阻断 1 小时，然后在 4 °C 下与稀释在阻断缓冲液中的初级抗体孵育过夜。
7. 初级抗体的稀释比例如下：γH2Ax，1:500；pRPA2-S，1:1,000；pCHK1S45，1:250；5BP1，1:500；cyclin A，1:100；pRAPII S2/S4，1:1,000。
8. 用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟后，载玻片在室温下与稀释在阻断缓冲液中的次级抗体孵育 1 小时。
9. 洗涤后，样品用冰冷的 4% PFA 固定 20 分钟。
10. 如果结合 DA FISH 染，固定的样品进一步用冰冷的 0.7% Triton X-100 和 0.1 M HCl（稀释在 PBS 中）在冰上渗透 10 分钟。
11. DA 用 1.5 M HCl 在室温下变性 0 分钟，然后在逐渐增加的乙醇浓度中脱水。
12. 稀释的 FISH 探针（Empire Genomics）在 75 °C 下预变性 分钟，然后加到风干的载玻片上。
13. 在 7 °C 下孵育过夜后，载玻片用 2× SSC 洗涤以去除非特异性结合，随后进行 DAPI 染。
14. 如需标记，使用 Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒（Invitrogen，产品编号 C10640）进行 EdU 染。

Validation of PC-DM and PC-HSR cell lines

PC-DM和PC-HSR细胞系的验证

Para_01

1. 从一个汇合的六孔板中使用 QIAamp DA Mini Kit (Qiagen) 按照制造商的协议提取基因组 DA。
2. 简而言之，收集单细胞并重悬于 200 µl 1× PBS 中，然后加入 20 µl QIAGE 蛋白酶 K 和 200 µl 缓冲液 AL。
3. 混合物脉冲涡旋 15 秒，并在 56 °C 下孵育 10 分钟。
4. 向样品中加入 200 µl 无水乙醇，并脉冲涡旋 15 秒。
5. 将整个混合物转移到 QIAamp Mini 离心柱中，并在 6,000g 下离心 1 分钟。
6. 弃去滤液，向柱中加入 500 µl 缓冲液 AW1。
7. 在 6,000g 下离心 1 分钟后，柱子再用 500 µl 缓冲液 AW2 洗涤一次。
8. 在全速下离心 分钟后弃去滤液。
9. 然后将柱子放入一个干净的 1.5 ml 微离心管中，加入 50 µl 缓冲液 AE，在 6,000g 下离心 1 分钟以重新溶解基因组 DA。

Para_02

1. WGS文库制备是使用EB的FS DA文库制备试剂盒按照制造商的协议进行的，具体参数如下：(1) 使用250 ng基因组DA作为输入；(2) 通过18分钟的孵育时间进行片段化，以产生200-450 bp的片段；() 最终文库大小分布为20-470 bp（即，第一次珠子选择使用0 µl的珠子体积，第二次珠子选择使用15 µl的珠子体积）；(4) 最终PCR扩增进行了四个循环。
2. 在ovogene使用ovaSeq进行PE150测序，以获得至少10倍的覆盖度。
3. 使用Trim Galore在默认设置下从原始fastq文件中去除接头序列，然后使用BWA-MEM将序列比对到hg8参考基因组，生成BAM文件。
4. 然后将BAM文件上传到GenePattern otebook中，在默认设置下进行AmpliconArchitect分析。

ecDA structure analysis

ecDA 结构分析

Para_01

1. 我们使用了 AmpliconSuite-pipeline（v.1.2.2，），该管道调用了 CVKit（v.0.9.9）、AmpliconArchitect（AA；v.1..r8）和 AmpliconClassifier（AC；v.1.1.2）。
2. 简而言之，分析管道首先从全基因组拷贝数调用中识别局域扩增的种子区域，然后在这些种子区域中，AA 联合分析拷贝数和结构变异，构建一个编码结构重排和拷贝数的局部基因组图。
3. AA 然后从基因组图中提取能够解释观察到的拷贝数和结构变异变化的基因组路径和循环。
4. AA 的输出传递给 AC，AC 应用基于规则的方法将从基因组图中提取的拷贝数、结构变异和结构模式与已知的局域扩增类型（如 ecDA）进行匹配。
5. 为了最小化由插入大小分布差异引起的测序伪影，我们将 AmpliconSuite-pipeline 参数 --AA_insert_sdevs 设置为 9。
6. 对于 PC 样本，还设置了 --downsample 1 以减少额外的测序伪影。
7. 其他情况下使用默认参数。

Para_02

1. 对于 COLO20DM/HSR，我们使用了参考文献10提供的通用 ecDA 区域和候选 ecDA 结构，并将坐标转换为 hg8。
2. 对于 GBM9ec/HSR 和 PC-DM/HSR，ecDA 区域是从 AA 输出文件中得出的。
3. 从 DM 样本中，我们将 AA 扩增子中感兴趣 ecDA 的拷贝数大于十的区域定义为 ecDA 区域。
4. 在 GBM9ec/HSR 中，我们还将 vIII 缺失包含在 ecDA 区域中。
5. 候选 ecDA 结构是从含有感兴趣癌基因的最高分配拷贝数的 AA 循环中得出的（GBM9：EGFR 和 PC：MYC）。
6. 对于 GBM9，ecDA 结构与先前发表的重建结果一致。
7. 循环 ecDA 可视化图是使用 CycleViz（）生成的。
8. 基因和局灶性扩增的拷贝数分别从 AA 图文件和 AC 特征基本属性文件中得出。
9. 局灶性扩增的结构相似性评分是使用 AC 中的 feature_similarity.py 脚本计算的，该脚本基于两个局灶性扩增之间的重叠基因组边界和共享结构变异来计算相似性评分。
10. 对于 PC 样本，我们使用了相关的 amplicon_similarity.py 脚本来获得相似性评分，因为使用 AC 无法轻松解析 ecDA 的确切边界。

Replication combing assay

复制梳分析

Para_01

1. 使用分子梳理测定法评估了 ecDA 中的复制叉速度。
2. COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞被接种到培养板中，并允许生长至对数期，新生 DA 合成通过依次等时间脉冲标记胸腺嘧啶类似物：CldU 和 IdU 来进行标记。
3. 脉冲标记后，细胞被收获并使用 Genomic Vision FiberPrep 套件嵌入琼脂糖块中。
4. DA 提取、梳理和免疫染按照 Genomic Vision 的 EasyComb 服务程序进行。
5. 盖玻片用 FiberVision 扫描仪扫描，图像使用 FiberStudio 软件（Genomic Vision）进行分析。
6. 复制叉速度是通过具有连续 CldU-IdU 轨迹的复制信号计算得出的。
7. 仅选择由 DA 纤维反染夹在两侧的完整信号进行分析。

Locus-replication combing assay

位点复制梳状分析

Para_01

1. 使用分子梳状分析评估了 MYC 位点的 DA 复制活性。
2. COLO20DM 和 COLO20HSR 细胞被接种到培养板中，并允许生长至对数期，新生 DA 合成通过胸苷类似物 CldU 和 IdU 进行等量时间的脉冲标记。
3. 脉冲标记后，细胞被收获并使用 Genomic Vision FiberPrep 套件嵌入琼脂糖凝胶块中。
4. DA 提取和梳状化按照 Genomic Vision 的 EasyComb 服务程序进行。
5. 针对 MYC 位点的 DA 标记 FiberProbes 由 Genomic Vision 生产，并与梳状 DA 杂交。
6. 通过测量对照样品中杂交探针的长度来验证理论与实验探针覆盖模式的一致性。
7. 复制信号和 DA 探针免疫染后，盖玻片用 FiberVision 扫描仪扫描。
8. 图像分析和测量使用 FiberStudio 软件（Genomic Vision）进行。
9. 叉速通过连续的 CldU–IdU 轨迹的复制信号计算得出。

Comet-FISH

彗星-荧光原位杂交

Para_01

1. 根据文献，进行了碱性彗星-FISH实验，略有修改。
2. 细胞通过胰蛋白酶消化收获，用PBS洗涤并置于冰上。
3. 将细胞稀释到7°C的低熔点（LMP）琼脂糖（IBI Scientific）中，最终浓度为0.7%，并在预涂的玻璃载片上铺展，覆盖盖玻片。
4. 在4°C下用碱性裂解液（2.5 M aCl，100 mM EDTA，10 mM Tris pH 10，1% Triton X-100，10% DMSO）进行过夜裂解，避光保护。
5. 第二天，将载片在Copolin罐中的碱性电泳缓冲液（200 mM aOH，1 mM EDTA，pH小于1）中平衡0分钟，随后在25 V下电泳0分钟。
6. 然后用Tris中和载片，在70%乙醇中脱水，并在室温下干燥。

Para_02

1. 为了通过荧光原位杂交（FISH）检测 ecDA，从 RP11-44018 BAC DA 制备了 Cy5 标记的探针，该 DA 经超声处理至 150 bp 并使用 DA 标记试剂盒（Mirus Bio）进行标记。
2. 载玻片在室温下用 0.5 M aOH 变性 0 分钟，然后在乙醇系列（70%，85%，95%）中脱水，并在室温下干燥。
3. 包含探针 DA（每张载玻片 200 ng）和 Cot-1 DA（每张载玻片 8 μg）的杂交混合物分别在 75 °C 下变性 10 分钟，并在 7 °C 下预退火 1 小时。
4. 将探针添加到载玻片上，用玻璃盖片铺展，并在湿盒中于 7 °C 下过夜孵育。
5. 第二天，载玻片在 42 °C 下用 2× SSC 和 50% 甲酰胺洗涤四次，随后在 42 °C 下用 2× SSC 洗涤两次。
6. 载玻片在 70% 乙醇中短暂浸没后风干。
7. 载玻片用含有 SYBR Gold（Invitrogen，稀释 1:10,000）的 Everbrite（Biotium）封片，并用指甲油密封。
8. 图像在 ikon Eclipse TE2000-E 显微镜上使用 ×60 油镜收集。

Cell viability assay

细胞活力测定

Para_01

1. 使用 CellTiter-Glo（Promega，目录号 G8461）进行了细胞活力测定，如先前所述。
2. 简而言之，细胞在加入抑制剂前一天接种到 84 孔板中。
3. 第二天，将等体积的溶剂或按指示浓度稀释的药物加入每个孔中，并在培养箱中孵育三天。
4. 第三天，在室温下平衡平板和 CellTiter-Glo 试剂 0 分钟后，将试剂加入每个孔中，并在室温下孵育 15 分钟。
5. 使用 Synergy 2 微孔板读数器测量发光。
6. 每种条件进行四次生物学重复。
7. 数据分析使用 GraphPad Prism（v.9.1.0）进行。

TUEL

TUEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法）

Para_01

1. 采用 TUEL 法（Invitrogen，目录号 C10617）检测凋亡过程中的 DA 片段化。
2. COLO20DM、COLO20HSR 和 SU16 细胞用 1 µM CHIR-124 处理指定时间。
3. 收集所有细胞，包括悬浮细胞，并使用细胞离心机（Thermo Scientific Cytospin 4 离心机）将细胞旋涂到载玻片上。
4. 载玻片用 4% PFA 固定，并用 0.25% Triton X-100 透化，然后在潮湿室中 7 °C 下用 TdT 酶催化反应标记自由双链末端 60 分钟。
5. 通过 Click-iT Plus TUEL 反应检测结合的 EdUTP，根据制造商的手册在 7 °C 下反应 0 分钟。
6. 载玻片用 DAPI 复染，并用 ProLong Diamond 抗褪剂封片。

Annexin V staining

Annexin V 染

Para_01

1. 通过流式细胞术使用 FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，货号 556547）检测细胞凋亡。
2. 细胞用 1 µM 的 CHIR-124 处理指定时间，收集所有细胞，包括悬浮细胞。
3. 用 PBS 洗涤两次并计数细胞后，将细胞重悬于试剂盒提供的 1× 结合缓冲液中，浓度为每毫升 1 × 10^6 个细胞。
4. 将 100 微升细胞悬液转移到 FACS 管中，并用 FITC Annexin V 和碘化丙啶染。
5. 在室温下孵育 15 分钟后，所有样本在 1 小时内使用 BD LSR II 流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。
6. 流式细胞术数据通过 Beckman Coulter Kaluza 软件（v.2.1）进行分析。

Microscope and image analysis

显微镜和图像分析

Para_01

1. 图像通过常规荧光显微镜或共聚焦显微镜拍摄。
2. 常规荧光显微镜使用 Leica DMi8 宽场显微镜和 Las X 软件（版本 .8.2.2771），采用 ×6 油浸物镜进行拍摄。
3. 共聚焦显微镜使用 ZEISS LSM 880 倒置共聚焦显微镜和 ZE（黑版 2.）软件（斯坦福 CSIF 设施）进行拍摄。
4. 每个视野都拍摄了 Z 堆栈，并选择最佳对焦堆栈用于后续图像分析，但图 a 除外，该图通过 ImageJ（版本 1.5t）进行了最大投影处理。

Para_02

1. 图像分析和量化使用开源软件 CellProfiler (v.4.2.1) 进行。
2. 对于焦点数量分析，通过自动阈值和分割分析了 DAPI 染、IF 染和 DA FISH 通道，分别对应细胞核、pRPA2S/γH2AX 焦点和 DA FISH 焦点。
3. 共定位分析使用基于对象的共定位方法进行。
4. 对于荧光强度测量，基于 DAPI 通道通过自动阈值和分割确定细胞核；通过测量每个细胞核内的平均荧光强度来获取平均荧光强度。

RS score computation

RS分数计算

RS score 1

RS 得分 1

Para_01

1. 基因集变异分析被用于评估 DA 修复反应（RSR）基因集在 TCGA 样本中的富集情况，使用 RA 测序数据进行评估。
2. RSR 基因集是根据 DA 修复反应缺陷影响的基因整理而成的。
3. TCGA 样本的每百万碱基转录本数（RA-seq TPM）值从 GDC 数据门户获取。
4. 基因集变异分析生成了上调和下调 RSR 基因的富集分数。
5. 最终的 RSR 分数确定为上调和下调富集分数之间的差异。

RS score 2

RS 得分为 2

Para_01

1. 从 TCGA 获取每个样本的 RS 签名得分，该得分来自文献，通过减去最小得分并除以最大得分将其线性转换到零和一之间。
2. TCGA 样本的 ecDA 状态分类按照先前出版物中的方法进行。

Both methods

两种方法

Para_01

1. 简而言之，1,921 个 TCGA 样本根据 AC（）被分为五种亚型：ecDA、断裂-融合-桥、复杂非循环、线性和无扩增。
2. 由于从短读数据中检测 ecDA 的挑战，具有断裂-融合-桥或复杂非循环状态的样本被从分析中移除。
3. 具有线性扩增和无扩增的样本被分类为 ecDA−。
4. 在去除转移样本和没有相同组织来源匹配 ecDA+ 样本的 ecDA− 样本后，共有 22 个 ecDA+ 和 582 个 ecDA− 样本被纳入分析。

CRISPR experiment

CRISPR实验

Para_01

1. 针对编码 CHK1 基因的 sgRA 模板寡核苷酸由 Integrated DA Technologies 合成，并连接到带有红荧光蛋白 (RFP) 的 CRISPR 表达载体 (Cellecta-pRSG16-U6-sg-HTS6C-UbiC-TagRFP-2A-Puro) 中。
2. 非靶向绿荧光蛋白 (GFP) (sgT-GFP) 质粒购自商业供应商。

Para_02

1. ecDA+ 和 ecDA− HeLa 细胞被转导了 sgCHK1-RFP 或 sgT-GFP 病毒，并在选择过程中加入了 2.5 µg ml−1 的嘌呤霉素（Sigma），持续 48 小时。
2. 在嘌呤霉素选择 48 小时后（第 0 天），表达 sgCHK1-RFP 或 sgT-GFP 的细胞数量相等，混合以获得 RFP 到 GFP 的细胞比例。
3. 在接下来的几天里，通过流式细胞术分析确定 sgCHK1-RFP 到 sgT-GFP 的比例。
4. 混合细胞培养物保持在亚融合状态。
5. 靶向 CHK1 的 sgRA 序列如下：

Para_0

1. o. 17: CCTGACAGCTGTCACTGGGT

Para_04

1. o. 18: GCTGTCAGGAGTATTCTGAC

Western blotting

西方印迹法

Para_01

1. 样品在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Fisher Scientific，产品编号78444）的放射免疫沉淀缓冲液（Boston BioProducts，产品编号BP-115）中裂解。
2. 使用双缩脲试剂盒（Fisher Scientific，产品编号2225）测定蛋白质浓度，并用4×样品缓冲液（Bio-Rad，产品编号1610747）制备样品。
3. 样品在4–12% Bis-Tris梯度凝胶（Fisher Scientific，产品编号WG140BOX）上进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad，产品编号1704271）上。
4. 膜用5% BSA在含Tween的Tris缓冲盐水中封闭1小时，然后加入稀释1:1,000的一抗，在4°C下孵育过夜。
5. 一抗孵育后，膜用含Tween的Tris缓冲盐水洗涤，并在二抗中孵育1小时。
6. 随后，膜与增强化学发光试剂（Fisher Scientific，产品编号2106）孵育，并在ProteinSimple FluorChemE上进行图像采集。

Detection of phosphorylated CHK1 Ser45 using the AlphaLisa SureFire assay

使用 AlphaLisa SureFire 检测试剂盒检测磷酸化 CHK1 Ser45

Para_01

1. 使用 Perkin Elmer 生产的 AlphaLISA SureFire Ultra p-CHK1 (Ser45) 检测试剂盒（目录号：ALSU-PCHK1-A10K）测量细胞中的化合物活性。
2. HT29 细胞在含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 McCoy 5A 培养基中培养，并接种到 96 孔板（Corning，目录号：599）中。
3. 化合物在 DMSO 中进行 10 点浓度梯度稀释，每点稀释 倍，并将化合物溶液加入每个含有细胞的孔中。
4. 将平板以 1,000 转/分钟离心 0 秒。
5. 将平板在 7°C 下孵育 16 小时。
6. 通过将平板轻轻敲击在纸巾上来去除上清液。
7. 用 PBS 溶液洗涤一次孔。
8. 向每个孔中加入新配制的裂解缓冲液，并在 400 转/分钟的摇床上振荡 0 分钟。
9. 将 96 孔细胞板以 1,500 转/分钟离心 1 分钟。
10. 从每个孔中转移 10 µl 裂解物到 84 孔 Optiplate（Perkin Elmer，目录号：6007290）中。
11. 向每个孔中加入 5 µl 接受者混合物，并将平板密封并用锡箔纸包裹。
12. 将平板在摇床上振荡 2 分钟，然后在室温下孵育 1 小时。
13. 向每个孔中加入 5 µl 供体混合物，并将平板密封并用锡箔纸包裹。
14. 将平板在摇床上振荡 2 分钟，然后在室温下孵育 1 小时。
15. 在 Perkin Elmer 的 EnVision 多模式板读取器上读取 AlphaLisa 信号。
16. 使用 XLfit（IDBS）或 GraphPad Prism（GraphPad 软件）将数据拟合到剂量-反应曲线，以计算每个测试化合物的 IC50 值。

Kinase HTRF biochemical assay

激酶HTRF生化检测

Para_01

1. 使用均相时间分辨荧光（HTRF）KinEASE测定法（Cisbio，目录号62ST1PEC）测量了CHK1酶活性。
2. 全长人类CHK1蛋白（GenBank登录号P_001265.1）购自Carna Biosciences, Inc.（目录号02-117）。
3. 酶反应在测定缓冲液中进行，最终浓度为：CHK1酶（0.012 ng/µl），MgCl2（5 mM）和DTT（1 mM）。
4. 为了确定化合物的剂量反应，DMSO储备溶液被稀释成十点浓度系列，每个浓度重复两次。
5. 将化合物溶液（50 nl）加入到84孔测定板（Greiner，目录号784075）中。
6. 向每个含有化合物溶液的孔中加入测定缓冲液（5 µl）。
7. 将板以1,000 rpm离心1分钟，然后在室温下孵育10分钟。
8. 通过加入底物缓冲液（每孔5 µl）启动反应，底物缓冲液的最终浓度为：STK底物1-生物素（120 nM）和ATP（1 mM）。
9. 将测定板以1,000 rpm离心1分钟，然后在室温下孵育60分钟。
10. 通过加入检测缓冲液（Cisbio，10 µl）停止反应，检测缓冲液的最终浓度为：STK抗体cryptate（0.25 nM）和链霉亲和素-XL665（7.5 nM）。
11. 将板以1,000 rpm离心1分钟，然后在25°C下孵育2小时。
12. 在EnVision多模式板读数器（Cisbio）上以HTRF模式读取HTRF信号。
13. 使用XLfit（IDBS）或Prism（GraphPad Software）将数据拟合到剂量-反应曲线，以计算每个测试化合物的IC50值。

Phospho-RPA2 S8 IF high content imaging

磷酸化RPA2 S8免疫荧光高内涵成像

Para_01

1. 光学底部96孔板（Thermo Scientific，目录号16505）用50 µl的1:1聚-L-赖氨酸（R&D Systems，目录号48-100-01）和聚-D-赖氨酸（R&D Systems，目录号49-100-01）在室温下包被小时。
2. 用100 µl的PBS（Gibco，目录号10010-02）洗涤孔一次，然后将所有液体从孔中移除，并在室温下完全干燥。
3. COLO20 ecDA+细胞以每孔15,000个细胞接种在100 µl的Roswell Park Memorial Institute培养基（Thermo Fisher，目录号22400089）中，培养基补充了10%的FBS（Omega Scientific，目录号FB-01）。
4. 细胞在7°C、5% CO2的培养箱中过夜附着。
5. 第二天，细胞用BBI-825处理16小时。
6. 处理后，移除所有培养基，用4%的PFA（Boston BioProducts，目录号BM-155）在室温下固定细胞15分钟。
7. 固定后，移除4%的PFA，并用100 µl的PBS洗涤孔两次。
8. 然后用100 µl的0.5% Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号T8787）在PBS中在室温下通透化15分钟。
9. 通透化后，用100 µl的PBS洗涤孔两次，然后用5%的山羊血清（Abcam，目录号ab7481）和1 mg/ml的BSA（GeminiBio，目录号700-100 P）在室温下封闭1小时。
10. 一抗（磷酸化RPA2（S8）；Cell Signaling，目录号54762）在封闭缓冲液中稀释至1:200，每个孔加入50 µl，并在4°C下过夜孵育。
11. 然后用100 µl的PBS洗涤孔三次，再用1:1,000稀释的二抗（山羊抗兔IgG Alexa Fluor Plus 594；Thermo Fisher，目录号A2740s）和1:1,000稀释的Hoechst 42（Biotium，目录号40046）在封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。
12. 然后用100 µl的PBS洗涤孔三次，最终洗涤后每个孔留有100 µl的PBS。
13. 使用CellInsight CX7 LZR Pro高内涵成像仪（Thermo Fisher Scientific）对平板进行成像，并使用HCS Studio Cell Analysis软件（Thermo Fisher Scientific）上的Spot Detector BioApplication模块分析数据。
14. 使用像素阈值法在核内检测到点状结构，含有三个或更多磷酸化RPA2 Ser8染点的细胞被认为是阳性信号。

Xenograft

异种移植

Para_01

1. 动物实验按照 Charles River Accelerator and Development Lab (CRADL) 动物护理和使用委员会批准的协议进行（协议号：EB17-010-066）。
2. 小鼠在单独通风的笼子中居，保持12/12小时的光照/黑暗周期，温度在65到75°F之间，湿度为0–50%。
3. SU16 胃癌细胞系购自 ATCC（目录号：CRL5974），并在 Roswell Park Memorial Institute 培养基（Gibco，目录号：22400-089）中维持，补充10% FBS（Omega Scientific，目录号：FB-02）。
4. 为了建立肿瘤，将1 × 10^6 SU16 细胞在200 µl PBS和Matrigel（Corning，目录号：5424）1:1混合液中通过皮下注射到9周龄的严重联合免疫缺陷小鼠（Envigo，品系代码186）的右侧腹部。
5. 每周测量肿瘤两到三次，每天记录体重。
6. 使用数字卡尺获取肿瘤体积测量值，肿瘤体积（mm³）通过公式计算：肿瘤体积 = (L × W²)/2，其中 L 是长度/最大肿瘤直径，W 是宽度/最小肿瘤直径，所有肿瘤在达到1,500 mm³之前收集。
7. 每组8只小鼠（历史上允许在载体和 infigratinib 之间确定显著性差异），随机分配到未盲处理的载体、infigratinib（15 mg kg⁻¹ 口服（PO）每日一次（QD））、BBI-2779（0 mg kg⁻¹ PO 隔日一次（Q2D））或 BBI-2779 和 infigratinib 的组合，当平均肿瘤体积为285（±10）/平均值（±标准误）mm³时开始。
8. 第22天取下一个载体肿瘤；由于肿瘤体积较大，该小鼠被安乐死。
9. infigratinib 在 pH 4.6 的醋酸钠缓冲液和聚乙二醇00的1:1混合液中配制。
10. BBI-2779 在 HyPure 分子生物学级水中用0.5%甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M0512）和0.2% Tween 80（AG Scientific，目录号：T-285）配制。
11. 对于体重变化超过-10%的小鼠，提供了剂量假期，并为整个组提供了 utra-Gel。
12. 在最后一次给药后6小时、24小时或6小时处死小鼠，并收集肿瘤进行 Western blot 或拷贝数分析。

Copy number analysis from xenograft samples

异种移植样本的拷贝数分析

Para_01

1. 为了进行拷贝数分析，将肿瘤切成10-20毫克的小块，并在液氮中快速冷冻。
2. 使用QIAcube DA提取试剂盒（Qiagen，编号511）提取DA。
3. 简而言之，将ATL缓冲液和蛋白酶K的混合物加入到冷冻的肿瘤小块中，并让它们恢复到室温。
4. 然后将肿瘤涡旋0秒，并放入56°C的培养箱中过夜消化。
5. 第二天早上，再加入150μl的ATL缓冲液，并再次涡旋0秒，以降低样品的粘度，然后再转移到S块上。
6. 其余的DA分离步骤遵循Qiagen的96 QIAcube HT协议。
7. 使用QIAxpert（Qiagen，目录号900240）定量双链DA的存在。
8. 将DA稀释至5 ng µl−1（5倍工作浓度）的Rase/Dase自由水（Thermo Fisher Scientific，目录号10977015）中，每孔加载2 µl到84孔板中。
9. 制备主混合物配方（主混合物（2×），5.5 µl；目标基因CA 20×，0.55 µl；端粒酶逆转录酶（TERT）20×，0.55 µl；无核酸酶水，2.2 µl），其中包含TaqPath Pro Master Mix 2×（Thermo Fisher Scientific，目录号A0866）作为参考的人类女性基因组DA（Promega，目录号G1521）、内部对照（人类TERT）和FGFR2或MYC目标基因探针（Thermo Fisher Scientific，目录号4400292）。
10. 在QuantStudio 6或7（Thermo Fisher Scientific）上运行反应，使用以下qPCR反应设置：变性/酶活化：95°C，10分钟；40个循环，每个循环包括变性95°C，15秒；退火/延伸60°C，60秒。

Quantificati and statistical analysis

量化和统计分析

Para_01

1. 所有统计方法和样本量已在图例或方法部分中说明。
2. 未使用统计方法预先确定样本量。
3. 默认测试类型为双侧统计测试，除非文中另有说明。
4. 研究者在实验和结果评估过程中并未对分配进行盲法处理。

Reporting summary

报告摘要

Para_01

1. 关于研究设计的进一步信息可在与本文链接的《ature Portfolio 报告摘要》中获取。

Para_01

1. 本研究生成的 GRO-seq、Ribo-Zero RA-seq、ChIP–seq、WGS 和 KAS-seq 数据可以通过 GEO 在访问号 .cgi?accGSE249657 下获取。
2. COLO20、GBM9 和 PC 的 AA 输出和拷贝数可以在 获取。
3. 本研究中使用的 COLO20 和 GBM9 的 WGS 数据在 SRA 上公开可用：/?term=PRJA50607111。
4. BBI-2779 可根据请求从 Boundless Bio 的 C.A.H. 处获得。
5. 源数据随本文一并提供。